家兔多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌与大肠杆菌生长曲线测定、耐药性、致病性评估
1 引言
近年来，我国家兔养殖业发展迅速，但细菌性疾病，尤其是多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、大肠杆菌（Escherichia coli）和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）等条件致病菌引起的感染，已成为制约产业健康发展的主要瓶颈。多杀性巴氏杆菌可引起兔巴氏杆菌病，表现为呼吸道症状、败血症等，对2~6月龄仔兔危害极大。大肠杆菌病则以腹泻、脱水为主要特征，是断乳后幼兔死亡的重要原因。奇异变形杆菌感染则可导致腹泻、流产甚至急性死亡。以往的研究多聚焦于单一病原体的致病性，但对于这三种细菌混合感染的情况，尤其是其在规模化养殖场中引发的协同致病效应，国内外报道相对较少。
2024年，宁夏某规模化肉兔养殖场爆发了以腹泻、呼吸困难和急性死亡为特征的高死亡率疫情。本研究团队从病死兔中同时分离出荚膜A型多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌和大肠杆菌，并通过系统的动物攻毒试验，揭示了混合感染对致病性的增强作用。本文旨在对该研究的技术路线、关键发现及其实践意义进行深度分析，重点探讨丹麦Biosense oCelloScope实时活体成像系统在细菌生长动力学研究中的应用价值，以期为家兔细菌性疾病的综合防控提供科学参考。
2 材料与方法分析
2.1 病原分离与鉴定策略的合理性
本研究采用“临床剖检→选择性培养基分离→革兰染色→生化特性观察→分子生物学鉴定”的多层级策略，确保了病原体鉴定的准确性与完整性。临床剖检发现肺部“花玻璃样”改变、脾萎缩、肠道胶冻状内容物等典型病变，为后续的靶向分离提供了方向。在分离培养环节，研究者巧妙利用了不同病原菌在培养基上的生长特性差异：多杀性巴氏杆菌在麦康凯琼脂上不生长，在TSA上形成边缘光滑的扁平菌落；奇异变形杆菌呈现独特的“游散性生长”和同心环状菌苔；大肠杆菌则在麦康凯上形成粉红色菌落。这种基于表型的初步筛选，有效降低了后续分子鉴定的工作量与成本。
分子鉴定方面，16S rRNA基因测序结合特异性基因（如巴氏杆菌kmt1基因）的PCR扩增，以及荚膜血清型分型（A型），构成了双重验证体系。系统发育分析显示，三株分离菌与标准菌株的同源性均超过99%，确认了其分类地位。这一流程体现了传统微生物学方法与现代分子技术的有机结合，是复杂样本中多病原鉴定的经典范例。
图1 三株分离菌的形态和培养特性观察A、B.分离菌株A分别在胰蛋白胨大豆琼脂养基和麦康凯琼脂培养基上的菌落形态；C.分离菌株A革兰染色（1 000×）；D、E.分离菌株B分别在胰蛋白胨大豆琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基上的菌落形态；F.分离菌株B革兰染色（1 000×）；G、H.分离菌株C分别在胰蛋白胨大豆琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基上的菌落形态；I. 分离菌株C革兰染色（1 000×）
2.2 生长曲线测定技术：丹麦Biosense oCelloScope的应用
本研究使用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统oCelloScope测定分离菌株的生长曲线。该系统通过连续拍摄微生物群落的高分辨率图像，利用算法识别并追踪单个细胞的分裂事件，直接生成活菌生长曲线，避免了传统OD值法无法区分活菌与死菌的缺陷。具体操作流程如下：将巴氏杆菌QF24-Pm01菌液接种于MTB培养基，奇异变形杆菌QF24-Ps02和大肠杆菌QF24-Ec03菌液分别接种于TSB培养基，每株菌设置三个重复孔，并设置空白对照。将接种好的48孔板放入仪器卡槽内，连接电脑进行实时监测。仪器参数设置为：波长600 nm，温度37 ℃，转速800 r·min⁻¹，间隔1小时检测一次，试验总时长24小时。使用GraphPad Prism 9.0处理原始数据并绘制生长曲线。
相较于传统的高通量微生物生长曲线分析系统，oCelloScope提供了以下技术优势：
• 活菌计数精确性：通过直接成像和分析，系统能够区分活菌与死菌碎片，生成的生长曲线真实反映活菌数量的动态变化。
• 菌落形态动力学：对于奇异变形杆菌这类具有群集运动特性的细菌，oCelloScope可实时记录菌苔扩散的速度、模式和形态演变，为研究其运动性与致病性的关联提供定量工具。
• 早期生长检测：该系统可在极低菌浓度下检测到生长信号，有助于揭示混合感染中弱势菌群的启动时间。
• 药物作用动态可视化：在药敏试验中，oCelloScope可记录单个细菌在抗生素作用下的形态变化（如丝状化、裂解），从而更深入地评估药物的杀菌或抑菌机制。
2.3 动物攻毒试验设计的创新性
本研究动物试验的最大亮点在于设计了多组混合感染模型，包括两两混合和三重混合，并与单一感染组进行对比。这种设计突破了传统“单病原-单疾病”的研究范式，真实模拟了临床常见的复杂感染场景。小鼠攻毒试验用于计算半数致死量（LD₅₀），家兔攻毒试验则更贴近目标物种，评估病理变化的相似性。两组试验互为补充，既获得了定量毒力数据，又验证了临床病理的一致性。
值得注意的是，研究者选择了腹腔注射（小鼠）和耳缘静脉注射（家兔）两种不同的攻毒途径，这可能影响病原体的分布与致病进程。腹腔注射更接近自然感染中的腹膜途径，而静脉注射则直接进入血液循环，可更快地引发全身性感染。这种差异需要在结果解读时予以考虑。
3 结果
3.1 混合感染对致病性的协同增强效应
小鼠攻毒试验结果显示，多杀性巴氏杆菌（QF24-Pm01）、奇异变形杆菌（QF24-Ps02）和大肠杆菌（QF24-Ec03）的LD₅₀分别为9.27×10⁵ CFU、1.43×10⁶ CFU和1.88×10⁷ CFU，表明巴氏杆菌的单独毒力最强。然而，在混合感染试验中，QF24-Pm01+QF24-Ec03组小鼠在攻毒后6小时即出现死亡，显著早于任何单一感染组（最早9小时）。家兔试验中，该混合组在24小时内达到100%死亡率，而巴氏杆菌单感染组需36小时。同样，QF24-Ps02+QF24-Ec03混合组家兔的死亡率（60%）高于各自单感染组（20%~40%）。这些数据明确显示，混合感染产生了超越简单相加的协同致病效应。
3.2 生长曲线测定结果
通过oCelloScope系统获得的生长曲线显示，QF24-Pm01、QF24-Ps02和QF24-Ec03分别从7.4~9.5小时、2.2~10.5小时和2.2~11.5小时处于对数生长期。该阶段细胞代谢旺盛，细菌以几何级数快速增殖，活菌数与时间呈指数关系。巴氏杆菌的延滞期较长，而奇异变形杆菌和大肠杆菌则迅速进入对数期。这一差异提示，在混合感染中，巴氏杆菌可能需要更长的时间建立初始感染灶，而奇异变形杆菌和大肠杆菌则能快速增殖，可能在感染后期占据主导地位。oCelloScope提供的活菌实时数据，使这一时序性特征的识别更为可靠。
图2三株分离菌株的生长曲线
3.3 病理变化的特异性与一致性
病理组织学观察揭示了混合感染导致的更严重组织损伤。在肺部，混合感染组出现更广泛的间质水肿、毛细血管充血及中性粒细胞浸润，且肺泡壁及血管内可见疑似细菌的嗜碱性颗粒物质，提示细菌定植更密集。肝脏方面，混合感染组肝细胞坏死和核溶解现象更为突出。肠道损伤则以绒毛断裂、上皮细胞脱落为主，大肠杆菌单感染组还出现了李氏隐窝的形成。
尤为关键的是，QF24-Pm01+QF24-Ps02+QF24-Ec03三重混合感染组家兔的肺脏呈现“花玻璃样”改变，脾脏萎缩呈深褐色，这些病理变化与临床自然死亡家兔的剖检所见高度一致。这一结果强有力地支持了“混合感染是该场肉兔高死亡率主要原因”的结论。
3.4 耐药性与毒力基因的协同网络
耐药基因检测显示，三株分离菌共同携带氨基糖苷类（aadB）、链霉素类（strA、strB）、β-内酰胺类（blaTEM）和磺胺类（sul1）耐药基因。此外，奇异变形杆菌还独有氯霉素类（floR）和β-内酰胺类（blaOXA）基因，大肠杆菌独有四环素类（tetA）和喹诺酮类（qnrS）基因。这种耐药基因的分布差异，提示耐药性可能通过水平基因转移在菌种间传播，尤其在混合感染环境下风险更高。
毒力基因方面，巴氏杆菌携带16种毒力基因，涵盖铁离子摄取系统（exbB、hgbA等）、黏附素（fimA、hsf2）和抗氧化酶（sodA）等，构成完善的侵袭武器库。奇异变形杆菌携带脲酶基因ureC和菌毛相关基因（atfC、atfA、pmfA），赋予其定植和破坏泌尿系统的能力。大肠杆菌携带的eaeA和fimC基因则与肠上皮细胞黏附密切相关。这些毒力因子的协同作用，可能是混合感染致病性增强的分子基础。
4 讨论
4.1 混合感染协同致病的可能机制
本研究表明，巴氏杆菌与大肠杆菌混合后致病性显著增强，奇异变形杆菌与大肠杆菌混合亦然。这一现象可能与以下机制有关：（1）免疫抑制与屏障破坏：巴氏杆菌的毒素和毒力因子可能抑制宿主局部免疫功能，破坏呼吸道黏膜完整性，为大肠杆菌和奇异变形杆菌的定植创造通道。（2）营养竞争与微环境改造：大肠杆菌和奇异变形杆菌可利用巴氏杆菌引起的炎症渗出物作为营养源，而奇异变形杆菌的脲酶活性可改变局部pH，促进其他细菌生长。（3）毒力因子的协同：不同病原体的毒力因子在感染时序上可能互补，例如巴氏杆菌的铁摄取系统帮助所有细菌在宿主体内获取铁元素，而大肠杆菌的黏附素则增强了整体定植效率。
4.2 精准诊断技术的应用价值
本研究采用oCelloScope系统进行生长曲线测定，获得了高精度的活菌动态数据。与传统OD值法相比，该系统能够区分活菌与死菌，直接反映活菌数量的真实变化，对于评估混合感染中细菌间的相互作用（如拮抗或共生）具有重要意义。此外，在药敏试验中，oCelloScope可实现高通量、实时动态监测，不仅能给出抑菌圈直径，还能记录细菌在药物作用下的形态变化，从而更全面地评价抗生素效果。将该系统纳入常规诊断流程，有助于提升复杂感染的诊断精度与治疗效率。
4.3 临床防控策略的启示
基于本研究结果，该兔场的防控策略需做出调整：首先，应重视巴氏杆菌疫苗的规范化免疫，避免因免疫不当导致群体免疫力下降。其次，加强生物安全措施，降低环境中大肠杆菌和奇异变形杆菌的载量。第三，鉴于分离菌株对头孢曲松敏感，对氟苯尼考、头孢呋辛等药物部分敏感，建议采用两种及以上敏感药物联合治疗，以延缓耐药性的产生。最后，应建立常态化的耐药性监测机制，及时掌握场内细菌耐药谱的变化。
5 结论
本研究成功从宁夏某规模化肉兔养殖场病死兔中分离鉴定出荚膜A型多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌和大肠杆菌，并通过动物攻毒试验证实了混合感染对致病性的协同增强效应。巴氏杆菌与大肠杆菌混合后，家兔死亡率升高、死亡时间提前，病理变化与自然病例高度吻合。三种分离菌均呈现多重耐药性，且携带多种耐药基因和毒力基因，增加了防控难度。研究提示，在预防巴氏杆菌感染的同时，必须加强对大肠杆菌和奇异变形杆菌的综合防控，并合理选用敏感抗生素。本研究使用丹麦Biosense oCelloScope系统完成了细菌生长曲线的测定，其高精度活菌成像能力为深入揭示混合感染的动力学机制提供了有力工具。
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