孢子制备

霉菌在MEA上于25°C培养7-14天。孢子悬浮于含0.01%吐温80的盐水蛋白胨（SPO）溶液（每升含5g NaCl、0.3g Na₂HPO₄·2H₂O、1g细菌蛋白胨，pH调至5.3±0.1）中，随后通过六层灭菌纱布过滤以去除菌丝片段。使用亮视野显微镜（Olympus BX40，日本）配合纽鲍尔计数室估算孢子浓度，并用SPO溶液调整至最终浓度10⁴孢子/mL。

D. hansenii菌株的脉冲场凝胶电泳和聚类分析

酵母菌株的DNA制备和脉冲场凝胶电泳（PFGE）的运行条件按照Petersen和Jespersen的方法进行。凝胶经紫外透射可视化并拍照。条带大小的估算使用LabImage 1D软件分析。聚类分析使用BioNumerics软件进行。条带图谱之间的相似性使用共享条带比例（Dice系数）确定，聚类分析采用非加权配对算术平均法（UPGMA法）计算。

D. hansenii的pH变化和细胞计数

所有D. hansenii菌株在添加了4%（w/v）NaCl的MYGP肉汤中过夜培养。使用分光光度计测量过夜培养物的OD600nm，然后用新鲜培养基稀释至初始浓度0.01±0.005（OD600nm）。细胞培养物在添加了4%（w/v）NaCl的MYGP肉汤中，于25°C下生长72小时。使用连接至pH计的电极测量pH，并在初始和终点时间点使用平板计数法在添加了4%（w/v）NaCl的MYGP琼脂上监测D. hansenii的生长。

D. hansenii无细胞上清液对霉菌生长的影响

对每株处于稳定生长期的D. hansenii菌株（在添加了4%（w/v）NaCl的MYGP肉汤中，于25°C培养72小时）制备无细胞上清液，通过离心（3000×g，10分钟），然后使用0.22μm孔径滤膜过滤上清液。

将100μL含10⁴孢子/mL的双倍浓度MEB与100μL从每株D. hansenii菌株收集的无细胞上清液，或100μL酵母蛋白胨（每升含5g细菌蛋白胨、3.0g酵母提取物、40g NaCl，pH 5.3）作为对照，加入96孔微孔板（Corning，纽约，美国）的孔中。使用oCelloScope™ Unisensor在25°C下培养48小时，通过测量生长曲线确定无细胞上清液对霉菌的抗真菌活性。oCelloScope检测系统（物镜4×）由Fredborg等人详细描述。图像距离为4.90μm，照明曝光时间为2ms。通过对流体样品进行延时扫描显微镜检查，每2小时在每个孔中生成一系列6张图像。使用UniExplorer中的分割和表面区域提取（SESA）算法自动生成生长曲线。

孢子萌发率使用ImageJ分析。萌发管长度超过孢子本身的孢子被视为已萌发孢子。对于每张图像，计数90-120个孢子，相对萌发率计算如下：

相对萌发率 = (g₁/t₁) / (g₀/t₀) × 100

其中g₁为添加无细胞上清液的已萌发孢子数，t₁为添加无细胞上清液的总孢子数，g₀为未添加无细胞上清液的已萌发孢子数，t₀为未添加无细胞上清液的总孢子数。萌发率计数的时间点根据Trinci的方法选择。

生长速率（μ）值使用Combase网站上的DMfit软件，基于上述生长曲线值和Baranyi及Roberts提出的模型进行分析。相对菌丝体生长速率计算如下：

相对菌丝体生长速率 = (μ₁/μ₀) × 100

其中μ₁为添加无细胞上清液的生长速率，μ₀为未添加酵母无细胞上清液的生长速率。R²>0.9的μ值被视为有效数据。

基于GC-MS光谱法测定挥发性化合物（VOCs）

D. hansenii无细胞上清液按上述方法制备。上清液的VOCs在动态顶空采样（DHS）系统中收集。每个样品含20mL上清液样品加1mL 4-甲基-1-戊醇（5ppm）作为内标。配备吹扫头的气体烧瓶在37°C水浴中平衡，磁力搅拌（200rpm），然后用氮气吹扫（100mL/min，20分钟）。VOCs通过Tenax-TA捕集管（250mg，目数60/80）收集。然后捕集管持续用氮气吹扫（100mL/min，10分钟）以去除多余水分。对所有样品进行重复动态顶空收集。VOCs使用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析，按照Liu等人的方法进行，并基于商业数据库（Wiley275.L）进行鉴定。通过与真实参比化合物的保留指数（RI）或文献报道的保留指数平均值进行比较，确认已鉴定的化合物。所有已鉴定的VOCs以总离子流图（TIC）中的峰面积进行半定量。

单一目标VOCs对霉菌抑制效果的评估

通过Spearman相关分析，基于D. hansenii产生的每种化合物的相对峰面积与抑制数据（相对萌发率和相对菌丝体生长速率）之间的相关性，选择挥发性化合物。具有显著强相关性（P<0.05）的化合物被选用于后续实验，并从Sigma-Aldrich购买。等级相关性的解释按照Akoglu的规则进行。

将含10⁴孢子/mL的MEB 200μL，分别补充乙酸、3-甲基丁酸、丙酮、2-戊酮和2-苯乙醇（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）至终浓度100、10⁻¹、10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵和10⁻⁶ mol/L，加入96孔板中。含10⁴孢子/mL的MEB 200μL作为对照。使用oCelloScope™ Unisensor在25°C下培养48小时，通过测量生长曲线确定单一已鉴定VOCs的抗真菌活性。相对萌发率和相对菌丝体生长速率按上述方法计算。此外，计算每种霉菌单一目标VOCs的IC50。通过将96孔微孔板在25°C下延长培养7天，评估五种单一目标VOCs对菌丝体膜形成长期影响，上述所列浓度通过目视检查评分菌丝体膜形成的抑制情况。

D. hansenii菌株产生的抑制性VOCs的定量

对两种酸（乙酸和3-甲基丁酸）、一种醇（2-苯乙醇）和两种酮（丙酮和2-戊酮）进行基于基质加标样品的标准曲线。使用定量离子的峰面积估算上述各VOCs由D. hansenii菌株产生的浓度。

数据分析

数据以均值±标准差表示，使用SPSS 17.0进行单因素方差分析。均值比较采用Duncan多重范围检验，统计显著性水平设为P<0.05。单一VOCs的IC50使用GraphPad Prism 5分析，Spearman相关分析使用R软件（"Hmisc"包）分析。

结果

从奶酪盐水分离的汉森德巴利酵母具有巨大的遗传多样性

图1 | (A)从丹麦奶酪卤液中分离的汉逊德氏酵母菌株的染色体多态性分析。采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行检测：先以150V电压、200个开关间隔持续24小时，随后以100V电压、700个开关间隔持续48小时。标记符号：H代表温格汉逊酵母；S代表酿酒酵母。(B)汉逊德氏酵母菌株的Dice/ UPMGA 聚类树状图。

从三家不同丹麦乳制品厂盐水分离的11株D. hansenii菌株的染色体图谱如（图1）所示，条带大小报告于补充表1。在菌株间，遗传多样性明显。染色体条带数量在5到7之间，大小从0.98到3.14 Mb。基于染色体图谱的聚类分析在60%的相似性水平上将11株D. hansenii菌株分为四个聚类（图1B）。九株D. hansenii菌株具有独特的图谱，而聚类III中的两株菌株（KU-11和KU-28）分别从乳制品厂A的两个不同罐（A1和A2）分离，具有相同的图谱。从乳制品厂A的两个罐（A1和A2）分离的D. hansenii菌株（KU-9、KU-10、KU-11、KU-12、KU-27、KU-28、KU-29和KU-30）被分为三个不同的聚类（聚类II、III和IV）。此外，来自乳制品厂C的菌株位于聚类I（KU-78和KU-80），与其他乳制品厂明显分离。相反，乳制品厂A和B之间没有观察到明显的分离，因为它们在聚类II中聚类在一起（KU-9、KU-12、KU-30和KU-72），尽管相似性较低。

观察到D. hansenii菌株间酸化和脱酸化能力的变异

在添加了4%（w/v）NaCl的MYGP中，于25°C下生长72小时的D. hansenii菌株的生长和pH变化如（表1）所示。D. hansenii菌株生长曲线的示例如补充图2所示。11株D. hansenii菌株的初始接种量为0.7±0.2×10⁴ CFU/mL，生长72小时后达到4.2±1.7×10⁷ CFU/mL。尽管所有11株D. hansenii菌株生长到相似水平，但它们的酸化能力存在巨大变异。生长72小时后，观察到六株D. hansenii菌株（KU-9、KU-11、KU-12、KU-28、KU-30和KU-72）将MYGP从pH 5.3酸化至最低4.3。相反，观察到四株D. hansenii菌株（KU-10、KU-27、KU-29和KU-78）将MYGP从pH 5.3脱酸化至最高6.1，而一株菌株（KU-80）在72小时生长期间pH没有显著变化。因此，与聚类分析相比，遗传多样性与酸化/脱酸化能力部分相关。酸化菌株位于聚类II和III中，而聚类IV包含四株脱酸化菌株中的三株。最后，聚类I包含一株脱酸化菌株（KU-78）和一株不改变pH的菌株（KU-80），然而，两株菌株之间检测到相当高的遗传差异，为62%。

表1 | D. hansenii菌株的生长情况及接种于含4%（w/v）NaCl的MYGP肉汤中72小时后的pH变化（25°C）

PFGE聚类	菌株	72小时后生长量(CFU/mL)	72小时后pH值
	KU-78	3.9x10⁷ ± 0.5x10⁷ᵃ	6.1 ± 0.0ᶠ
I	KU-80	8.3x10⁷ ± 0.5x10⁷ᶜ	5.2 ± 0.1ᵈ
II	KU-12	3.5x10⁷ ± 0.9x10⁷ᵃ	4.5 ± 0.0ᵇ
II	KU-30	2.7x10⁷ ± 0.7x10⁷ᵃ	4.8 ± 0.0ᶜ
II	KU-9	4.0x10⁷ ± 0.2x10⁷ᵃ	4.3 ± 0.2ᵃ
II	KU-72	3.4x10⁷ ± 0.4x10⁷ᵃ	4.5 ± 0.1ᵇ
III	KU-11	3.7x10⁷ ± 0.6x10⁷ᵃ	4.5 ± 0.1ᵇ
III	KU-28	2.6x10⁷ ± 0.5x10⁷ᵃ	4.6 ± 0.1ᵃᵇ
IV	KU-10	3.9x10⁷ ± 0.7x10⁷ᵃ	6.1 ± 0.1ᶠ
IV	KU-29	4.3x10⁷ ± 0.6x10⁷ᵃ	5.9 ± 0.1ᵉ
IV	KU-27	6.2x10⁷ ± 0.6x10⁷ᵇ	6.1 ± 0.1ᶠ

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