一天完成上百个化合物初筛，BioSense高通量方案。
一 方案总体思路与通量规划
本方案依托丹麦BioSense oCelloScope FluidScope快速扫描能力，实现单日完成上百个小分子化合物、天然提取物、多肽高通量初筛。采用单浓度初筛模式快速剔除无活性化合物，仅将阳性候选物转入后续梯度MIC精筛；单块96孔板最多容纳80个受试化合物，单日可连续运行2～3块微孔板，实现单日160～240个化合物高通量初筛。
传统终点微孔筛选仅能获得终点浊度，极易受色素、沉淀干扰产生假阳性；本方案采用时序成像结合TA浊度双指标，搭配SESA静态杂质过滤，同步观察菌体形态变化，在初筛阶段区分真实抑菌效果、药物结晶以及溶剂干扰，大幅降低假阳性比例。
初筛核心目标：快速筛选具备抑制活性的候选化合物；主要判定指标为AUC生长抑制率、菌体像素总面积时序曲线；可选择4～6 h提前判定，无需等待传统16～20 h终点读数，进一步压缩整体实验周期。
二 实验前期准备（高通量前置标准化，减少上机等待时间）
1 化合物库预处理规范
所有受试化合物统一配制高浓度母液，推荐100×储备液，使用0.22 μm无菌滤膜过滤除菌；按照化合物编号建立信息清单，记录溶剂类型、储备浓度。
尽量统一溶剂体系，常用DMSO、甲醇等；严格控制体系内溶剂终浓度，通常不高于1%，避免溶剂自身产生抑菌作用；单独配制溶剂对照母液。
提前排查溶解度极差、极易析出沉淀的化合物，减少上机后大量假阳性干扰；高色素天然提取物单独分组做好标记。
2 菌株标准化制备
受试细菌使用MH肉汤连续传代2次，培养至对数生长期，统一调整终接种浓度5×10⁵ CFU/mL；真菌采用RPMI 1640培养基，孢子终浓度1×10⁴ CFU/mL。
大批量统一配制菌悬液并分装备用，保证多块微孔板接种浓度保持一致，消除批次间差异。
3 仪器参数优化（高通量快速扫描专用参数）
提前24 h将恒温培养箱稳定至目标温度，oCelloScope放入箱内预热2 h，完成光路灰度校准，采集空白培养基BCA基线模板。
高通量快速扫描参数设置：
采用稀疏分层Z轴扫描模式，覆盖孔底主要菌体分布区域，缩短单块微孔板扫描耗时；开启SESA静态杂质过滤、动态BCA基线校正；
扫描间隔设置30 min；快速初筛模式总监测时长6 h，需要更高严谨性可延长至12 h；
关闭超高分辨率图像存储，仅保留核心Z轴堆栈图像，降低存储压力与扫描耗时。
优化参数后，整块96孔板单次完整扫描控制在3 min以内，保障时序任务按时执行。
三 96孔微孔板标准化排布（单浓度高通量初筛布局）
1 孔板布局
微孔板外圈全部填充无菌培养基作为蒸发缓冲孔，缓解边缘蒸发效应。
板内有效区域：每孔对应1个受试化合物，设置单一终浓度开展初筛，常规初筛浓度可选用128 μg/mL或对应摩尔浓度。
每块微孔板统一设置全套对照组：
阳性生长对照：菌液+培养基，无化合物；
阴性空白对照：无菌培养基，无菌株；
溶剂对照：菌液+最高浓度溶剂；
无菌药物对照：代表性化合物浓度搭配无菌培养基，用于识别沉淀引发的假阳性。
2 标准化加样流程
加样顺序固定为无菌培养基→化合物母液→标准化菌悬液，轻柔吹打混匀，每孔终体积统一100 μL。
全部加样完成后300 g低速离心1 min，去除孔内微小气泡；使用疏水透气封板膜密封微孔板；放置于同温操作台静置30 min平衡温度，减少冷凝水生成。
多块微孔板分批制备，第一块微孔板上机运行期间，同步完成下一块微孔板加样预处理，实现连续不间断上机，最大化单日筛选通量。
四 连续上机高通量运行完整操作流程
1 第一块微孔板上机
微孔板平稳放置于设备板架并锁紧卡扣；UniExplorer软件新建时序任务，载入预设高通量扫描参数、BCA基线模板；录入微孔板化合物编号清单，启动全自动时序扫描。
系统持续采集菌体像素总面积、等效TA浊度，自动保存时序图像堆栈。
2 批次轮换操作规范
当前微孔板运行至设定监测时长，任务结束，及时备份工程文件并导出数据。
取出微孔板，清洁设备板架；放入预先制备完成的下一块微孔板，重新载入基线模板，启动新一轮扫描；多板依次循环运行。
设备持续放置在恒温培养箱内部，无需反复取出整机，仅更换微孔板，减少温度波动以及设备反复预热消耗的时间。
3 实时初步筛查
UniExplorer软件支持实时查看生长曲线，运行至4 h即可初步判别明显活性化合物，提前标记阳性候选，减轻后期数据分析工作量。
五 高通量初筛数据判定标准（快速区分活性/无活性，过滤假阳性）
1 定量指标阈值
以阳性对照组AUC生长面积作为基准，计算各组化合物AUC生长抑制率；
抑制率≥50%初步判定为活性候选化合物，进入后续MIC梯度精筛；
抑制率＜30%直接判定无活性，予以淘汰；
30%～50%区间列为可疑样品，调取时序图像逐一复核。
2 图像复核核心规则（规避假阳性）
若TA浊度数值上升，但时序图像没有持续增殖菌体，仅存在静态结晶、沉淀，判定为假阳性，直接剔除；
像素面积持续上升，图像可见菌体不断增殖，判定无抑菌活性；
像素面积长期维持低位，图像中菌体数量无明显增长，判定具备抑菌潜力。
3 初筛结果分级清单
一级候选（强活性）：AUC抑制率≥70%；
二级候选（中等活性）：50%≤抑制率＜70%；
可疑样品：30%≤抑制率＜50%，需要人工复核图像；
无活性样品：抑制率＜30%，直接淘汰。
六 数据导出、自动化整理与后续实验衔接
1 数据导出规范
每块微孔板实验结束后备份完整工程文件；导出UTF-8编码CSV时序数据；批量导出候选化合物关键时间点图像。
汇总所有化合物抑制率，建立总筛选数据表，同步标注假阳性剔除记录。
2 初筛与精筛衔接流程
初筛得到的一、二级候选化合物，后续采用2倍浓度梯度开展动力学MIC实验，同步测定AUC抑制面积、观察菌体裂解、丝状化等形态变化；
无活性化合物直接归档，不再开展梯度实验，大幅节约耗材与仪器使用时长。
七 实验质控与通量提升关键优化要点
1 通量提升措施
启用快速扫描参数，缩短单层扫描耗时；优先采用6 h快速初筛模式，不强制开展20 h全程监测；
样品分批制备，仪器不间断轮替上板，消除设备空窗等待时间；
初筛阶段统一采用单一化合物浓度，浓度梯度实验后置至精筛阶段。
2 常见干扰防控
天然提取物、中药、多肽体系极易析出沉淀，必须依靠无菌药物对照组结合SESA算法区分杂质与活菌；
严格控制溶剂终浓度，每一块微孔板配套独立溶剂对照；
复孔变异系数＞20%的孔位做好标记，数据分析时予以剔除。
3 污染防控
化合物母液完成无菌过滤；移液枪枪头一次性使用；操作区域定期紫外消毒，避免孔间交叉污染。