无质粒微生物平台可用于在常温下实现闭环PET回收和可持续升级循环（二）
3.3 无质粒EG营养型大肠杆菌的构建
为实现不依赖质粒的表达，采用基于CAST系统的多拷贝染色体整合策略，将fucO-aldA表达盒（由PgyrA启动子驱动）整合至MG1655(DE3)菌株，成功构建了无需质粒的EG营养型菌株（图3a）。共获得四株无质粒菌株，其整合拷贝数分别为：MGEG25（5拷贝）、MGEG26（7拷贝）和MGEG27（8拷贝）。无质粒菌株的生长表现优于质粒依赖型菌株MGEG02（图3b,c）。MGEG27菌株在84小时内实现了90.0%的EG消耗率，较MGEG02菌株提升29.0%。这是首例报道的能在EG上稳健生长的无质粒大肠杆菌。染色体整合技术的应用不仅提高了菌株稳定性、消除了持续抗生素筛选的需求，还为基于EG的生物生产提供了可扩展的底盘系统。
图3. 通过CAST介导的多拷贝基因组整合构建无质粒的EG营养型大肠杆菌。
3.4 无质粒条件下EG营养型大肠杆菌的生长评估
为优化EG营养型菌株MGEG27的培养条件，评估了温度与底物浓度对其生长的影响。在90 mM EG的M9培养基中，30°C和33°C下的生长显著优于25°C和37°C，其中33°C在前60小时略占优势（图4a）。EG耐受性实验显示（图4b），菌株严格依赖EG作为碳源，在无EG条件下不生长。最适EG浓度为180 mM和360 mM，培养60小时后OD600分别达5.26和5.07。90 mM时生长较慢（OD600=3.44），而当浓度超过360 mM后，生长速率因渗透压升高而逐渐下降。
在最优条件（33°C, 180 mM EG）下培养，菌株于48小时内达到最大OD600（5.19），72小时消耗79%的EG（图4c）。代谢物监测表明，有毒中间体GLA仅短暂积累（48小时峰值0.13 mM），随后被迅速代谢（图4d）；而GA则稳定积累至72小时的6.27 mM，未达到抑制水平（图4e）。
综上所述，菌株MGEG27能在较宽的温度与EG浓度范围内高效生长，并可有效规避毒性中间体的积累，显示出其作为EG基生物制造底盘细胞的良好稳定性与潜力。
图4. 菌株MGEG27的培养参数优化与代谢物动态分析。
3.5 通过适应性实验室进化（ALE）增强EG营养型大肠杆菌对EG的同化能力
通过适应性实验室进化（ALE），在180 mM EG的选择压力下对菌株MGEG27进行连续传代，成功分离出生长显著增强的进化菌株ALE1-7（图5a, b）。在最优条件（33°C, 180 mM EG）下培养24小时后，ALE1-7的OD600达到3.14，其生长分别较出发菌株MGEG27和MGEG02提升了103.1%和255.3%（图5c）。
菌落形态提供了直观证据：在EG平板上，MGEG02形成稀疏小菌落，MGEG27为中等菌落，而ALE1-7则形成致密大菌落，与其优异的生长动力学相符。生长曲线分析进一步证实（图5d, e）：在以等碳摩尔数的葡萄糖或EG为唯一碳源时，ALE1-7的生长均显著优于原始宿主MG1655(DE3)。重要的是，其对葡萄糖的利用能力未受影响，表明ALE专一性地增强了EG代谢通路。
ALE1-7在EG培养基中的最终生物量已达到野生型菌株利用葡萄糖时的水平，证明了EG可作为其高效生长的碳源。本研究结果与ALE在其他体系中的应用效果一致，例如提升酵母对半乳糖的利用或恶臭假单胞菌对EG的代谢速率。这些数据共同表明，ALE是强化微生物利用非天然碳源（如EG）的一种有效策略。
图5. 通过适应性实验室进化（ALE）提高大肠杆菌MGEG27对EG的同化效率。
3.6 可持续的、闭环的PET降解系统的设计与验证
为评估ALE1-7菌株的应用潜力，首先通过酶解、酸沉淀及过滤的简化流程制备了富含乙二醇（EG，5.6 g/L）且不含对苯二甲酸（TPA）的PET水解液（图6a左）。该水解液经适当稀释并补充盐分后，可支持ALE1-7高效生长，且其效果优于人工添加EG的合成培养基（图6a右），表明PET水解液是一种经济可行的微生物培养基。
将ALE1-7进一步改造，分别表达PET水解酶BHR4M、TFU6M和FastPETase，获得工程菌MGEG60、MGEG61和MGEG62。酶活检测显示三者均成功表达，其中表达FastPETase的MGEG62活性最高（2.73 ± 0.18 U/mL）（图6b）。基于此，构建了一个闭环降解系统：工程菌利用PET水解液中的EG生长，同时分泌水解酶降解共培养的PET塑料（图6c）。35天后，上清中检测到TPA的释放（MGEG60: 1.12 mg/L；MGEG61: 0.79 mg/L；MGEG62: 0.32 mg/L），而不表达水解酶的对照组则无TPA生成（图6d）。此外，在MGEG62的反应体系中检测到疑似对苯二甲酸乙二醇酯（EGT）的副产物峰。
该系统实现了PET降解与降解产物EG再利用的耦合，无需外加碳源，为塑料废物的生物循环提供了一种可持续、可扩展的解决方案。
图6. 工程化改造的EG利用菌株在无TPA的PET水解物中实现闭环PET生物降解的应用。
4.结论
在这项研究中，首次开发出一种不含质粒、能高效利用乙二醇（EG）作为唯一碳源的大肠杆菌，该菌株可在48小时内实现近完全的EG消耗。随后研究还构建了一个闭环PET降解系统，其中工程化大肠杆菌不仅能利用PET水解液中的EG进行生长，还能通过表达PET水解酶来降解PET。该系统成功实现了PET降解与基于EG的微生物生长同步进行，并产生PET水解产物对苯二甲酸（TPA）。这一工程化微生物平台为塑料废弃物升级循环提供了可扩展且可持续的解决方案，为PET塑料的闭环回收展现了前景广阔的新途径。未来研究应着重拓展底物范围、优化合成高附加值产品的代谢通量，并评估该系统在工业条件下的运行性能。
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