黑曲霉分生孢子在不同成熟阶段的复杂性和异质性研究
研究背景：黑曲霉是一种广泛存在的真菌，具有很强的适应性和生存能力。它们的分生孢子是其无性繁殖的主要结构，这些孢子在空气中非常丰富，对人类健康和生态系统都有重要影响。黑曲霉的分生孢子形成过程包括营养生长后，特殊的气生菌丝分化为分生孢子载体，这些载体延伸到空气中并形成孢子链。尽管黑曲霉的分生孢子在生态系统中具有重要作用，但其成熟过程中的特性变化尚不清楚。本研究探讨了这些无性生殖结构上分生孢子的成熟过程。在分生孢子载体上发育了2天、5天和8天的色素化分生孢子对热的耐受性相似，并且通过二氧化碳释放和代谢探针Tempone的转化显示出代谢活性。当2天的分生孢子与5天和8天的孢子相比较时，有645-2421个基因的表达发生了2倍的变化。与较老的孢子相比，2天的分生孢子的细胞壁中更容易提取黑色素。此外，2天的分生孢子的甘露醇含量和萌发率更高。8天的分生孢子通过水分散的效率较低，但在风和疏水移动物体的分散方面没有观察到差异。这些数据以及在实验中只有少数分生孢子被分散的事实表明，黑曲霉的一个菌落释放出的分生孢子是异质性的。这种异质性在环境条件迅速变化的环境中（例如水的可用性）会提供选择性优势。
丹麦Biosense微生物生长动态监测系统的应用
将10⁷个分生孢子稀释至5×10⁴个孢子/毫升的浓度，接种于含有25 mM麦芽糖的转化培养基（TM）中。扫描区域长度设置为2205微米，扫描区域大小设置为70-700像素，最大物体数量设置为1000。从接种后2小时开始扫描，每小时扫描一次，直到微菌落开始覆盖休眠或萌发的孢子。oCelloScope能够实时监测黑曲霉分生孢子的萌发过程，包括孢子的膨胀、萌发和菌丝生长。通过分析孢子的表面积和圆度变化，oCelloScope可以将孢子精确分类为休眠孢子、肿胀孢子、萌发孢子和菌丝，从而提供详细的萌发动态数据。提供了孢子萌发的动态图像，还生成了详细的数值数据，包括孢子的表面积、圆度等参数，为研究孢子萌发机制提供了丰富的信息。
实验结论
通过一系列实验，深入探讨了黑曲霉（Aspergillus niger）分生孢子在分生孢子载体上的成熟过程，揭示了分生孢子在不同成熟阶段的特性变化及其生态意义。通过比较2天、5天和8天的分生孢子，发现有645-2421个基因表达发生了2倍以上的改变。其中，许多上调基因的功能未知，而下调基因多与代谢和生物合成过程相关。所有测试的分生孢子都显示出代谢活性，通过PDT的电子自旋共振（ESR）信号强度降低和CO2释放来证实。2天的分生孢子更容易提取黑色素，而甘露醇含量和萌发率在2天的分生孢子中更高。8天的分生孢子通过水分散的效率较低，但在风和昆虫传播方面没有观察到差异。2天的分生孢子萌发速度更快，而5天和8天的分生孢子萌发速度较慢。热处理（55°C，5分钟）减缓了所有分生孢子的萌发速度，但没有观察到不同成熟阶段的分生孢子在热抗性上的差异。
图1、黑曲霉2日龄、5日龄和8日龄分生孢子中海藻糖（浅灰色阴影）、甘露醇（深灰色阴影）和甘油（黑色阴影）的量（pg分生孢子）。误差线表示技术和生物学重复的标准差
图2、用盐水吐温（深灰色阴影）和NaOH（浅灰色阴影）提取的2日龄、5日龄和8日龄的黑曲霉分生孢子的黑色素量（A）以及2-（管2）、5-（管3）和8日龄（管4）分生孢子的色素沉着用水和NaOH提取后，未提取的2日龄分生孢子作为对照（管1）（B）。（C）显示了管2和4提取的孢子颗粒的放大倍数。对比度和亮度也同样增加。误差线表示生物重复的标准差。
图3、PDT的减少表明黑曲霉2、5和8日龄分生孢子的代谢活性。（A）在分生孢子存在下，t=0（上层）和t=30 min（下层）时1 mM PDT的ESR谱图。高场（右）线（H）的高度用于量化PDT。（B）Hheight在2日龄（正方形）、5日（圆）和8（三角形）分生孢子中的减少。使用热灭活2日龄的分生孢子作为对照（三角形O）。误差线代表生物重复的标准差，r.u.是相对单位。
图4、在2-（A）、5（B）和8-（C）日龄生物重复分生孢子的情况下，表明代谢活性的CO2水平增加，通过CO2传感器电压（mV）的降低进行监测。
图5、在培养基中孵育2-6小时后，2-（A）、5-（B）和8-（C）日龄孢子的大小分布。条形代表静止分生孢子（21-42升，无阴影条）、肿胀的分生孢子（42-76升，浅灰色条）、发芽分生孢子（76-106升深灰色条）和菌丝生长（106-212升，黑色条）。由2日龄分生孢子（条纹线）、5日龄（虚线）和8日龄分生孢子产生的所有物体的平均大小（D）。
总结
本论文主要就黑曲霉（Aspergillus niger）分生孢子在分生孢子载体上的成熟过程进行研究，旨在揭示分生孢子在不同成熟阶段的特性变化及其生态意义。黑曲霉是一种广泛分布的真菌，其分生孢子在空气中极为丰富，对生态系统和人类健康具有重要影响。研究通过一系列实验，探讨了分生孢子在基因表达、代谢活性、细胞壁成分、水分分散效率和萌发率等方面的变化。oCelloScope在本研究中发挥了重要的作用，oCelloScope能够实时监测黑曲霉分生孢子的萌发过程，包括孢子的膨胀、萌发和菌丝生长，它不仅提高了孢子萌发监测的效率和准确性，还为研究孢子萌发机制提供了丰富的数据支持。研究通过详细的实验和分析，揭示了黑曲霉分生孢子成熟过程中的复杂性和异质性，为理解这种真菌的生态适应性和生存策略提供了新的视角。同时，研究结果也为进一步探索黑曲霉的基因调控和代谢机制提供了基础。
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