基于ocelloscope实时监测的铁对两种热带优势藻类生长动态的影响研究
摘要：拟柱孢藻（Cylindrospermopsis raciborskii）和角星鼓藻（Staurastrum spp.）是热带亚热带浮游植物群落中的常见优势种类，为了解铁对两种浮游植物季节动态和生长的影响，本文通过对典型热带水库的野外调查，分析铁与两种藻生物量和相对生物量的季节动态的关系，并通过室内实验分别以无机磷（KH2PO4）和有机磷（C6H13O9P）为磷源，比较三种铁浓度（0.029、0.29和0.689 mg/L）下拟柱孢藻（C. raciborskii，N8）和角星鼓藻（Staurastrum sp.，FACHB-1449）的比生长速率、铁载体产量和碱性磷酸酶活性的差异。结果显示，拟柱孢藻和角星鼓藻是浮游植物群落的主要优势种类，两者的生物量最大占到总生物量的82%以上；两者对环境变量响应的区别主要体现在对溶解性铁浓度变化的响应差异上，拟柱孢藻生物量与溶解性铁有显著的线性回归关系，但角星鼓藻的生物量与铁没有显著线性回归关系。室内实验中，拟柱孢藻N8的比生长速率在无机磷源铁浓度为0.689 mg/L条件下最大，为0.098±0.01 d-1，两种磷源条件下比生长速率均随铁浓度降低而显著降低，六个实验组均检到铁载体；六个实验组角星鼓藻FACHB-1449的比生长速率没有明显差异，平均为0.079±0.001 d-1，均未检出铁载体，磷源和铁浓度对其比生长速率的影响不显著；有机磷源条件下，拟柱孢藻N8实验组碱性磷酸酶活性均显著高于角星鼓藻FACHB-1449实验组，拟柱孢藻N8实验组酶活性随铁浓度降低而显著降低，但角星鼓藻FACHB-1449各实验组的碱性磷酸酶活性无明显差异。以上结果表明，水体中溶解性铁的供应对拟柱孢藻的种群动态和优势有重要作用，与角星鼓藻相比，拟柱孢藻的生长更易受到铁的限制，尤其在无机磷缺乏、磷源主要以有机磷形式供应时，铁对拟柱孢藻生长的限制作用增强。
拟柱孢藻（Cylindrospermopsis raciborskii）和角星鼓藻（Staurastrum spp.）是热带和亚热带水体的常见优势种类，两个种类存在演替现象。例如，对非洲湖泊研究的综述中指出，丝状蓝藻（拟柱孢藻、长孢藻、假鱼腥藻）常在雨季开始之前成为浮游植物群落的优势类群，鼓藻目种类（鼓藻、角星鼓藻）常在雨季成为优势种类；在巴西多座湖泊中发现角星鼓藻在分层时期成为浮游植物群落中的绝对优势种，拟柱孢藻在去分层时期常成为优势种。对海南的赤田水库、广东的大沙河、高州等多座水库的调查也发现，拟柱孢藻是这些水库的优势种，但通常在水体去分层时期形成优势，而在水体强分层时期浮游植物群落以角星鼓藻为绝对优势种。拟柱孢藻是热带亚热带水库中常见的水华蓝藻，具有产毒能力，已有研究表明拟柱孢藻对常量元素（N和P）具有较强的竞争能力，尤其能适应低磷环境。角星鼓藻为单细胞绿藻，细胞个体大，能耐受资源胁迫，对低磷环境有很好的适应性。已有的研究主要集中在大量元素对两种藻类生长的影响上，对微量元素的影响尚缺乏充分的认识，而基于常量元素的竞争能力能够解释拟柱孢藻占优势却不能很好地解释其相对生物量受到限制。
铁是浮游植物生长需求最大的微量元素，主要分布于浮游植物细胞的光合系统中。光合系统中铁含量占整个细胞总铁含量的50%~90%，浮游植物铁需求的种间差异主要由光合系统PSI（含12个Fe原子）和PSII（含2~3个Fe原子）的比例决定。蓝藻比绿藻具有更高的PSI:PSII比，因此铁需求更高。室内实验表明，相对于小球藻、栅藻等绿藻，微囊藻、颤藻等蓝藻的生长更容易受铁浓度影响，在低铁浓度下的比生长速率明显降低。在铁限制条件下，浮游植物能产生高效螯合铁离子的铁载体，同时在细胞外膜上产生铁受体蛋白，特异性识别铁离子—铁载体复合物，并将铁离子转运至胞内从而缓解铁限制，因此铁载体产量常用于指示细胞受到铁限制状态。
在自然水体中，铁是否能成为限制性资源，不仅取决于浮游植物的铁需求，还取决于水体中铁的生物可利用性。浮游植物生长主要在真光层，调查数据显示，热带水库真光层中总铁浓度常低于0.5 mg/L，溶解性铁浓度常低于0.1 mg/L。有研究提出，水体中总铁浓度低于0.1 mg/L时，蓝藻生长受到限制。此外，热带水库中磷主要以有机颗粒态形式存在，溶解性活性磷浓度普遍低于0.01 mg/L，有机磷的利用能力对维持浮游植物生长有重要的作用。在无机磷不足的环境中，通过产生碱性磷酸酶水解有机磷是浮游植物利用有机磷源的主要途径，这一过程中的能量传递、氮的利用都需要铁的参与。基于蓝藻和绿藻的铁需求差异，我们推测在热带水库铁浓度范围内，铁对拟柱孢藻和角星鼓藻生长的限制性作用存在差异，尤其在无机磷缺乏条件下，细胞铁需求可能增加进而导致铁限制作用增强。
为了验证以上推测，本文选择具有拟柱孢藻和角星鼓藻季节演替现象的典型水库（大沙河水库）开展野外调查，分析铁在拟柱孢藻和角星鼓藻生物量和相对生物量季节动态中的作用；并选取分离自热带水库的拟柱孢藻（C. raciborskii，N8）和热带亚热带常见角星鼓藻（Staurastrum sp.，FACHB-1449）为实验藻株，分别以无机磷和有机磷为磷源，以热带水库湖上层铁浓度值和相关研究提出的蓝藻生长受限制的铁浓度阈值为参考依据，设置三个铁浓度，开展铁对两种藻生长作用的比较研究。结合野外调查和室内实验结果，分析铁对拟柱孢藻和角星鼓藻生物量季节动态和生长的作用，为进一步阐明热带水库拟柱孢藻和角星鼓藻的演替机制以及为拟柱孢藻水华的防治提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 野外调查
1.1.1 水库概况
大沙河水库（22°32′N，112°30′E）位于广东省开平市，是开平市区重要的供水水源地。水库流域面积217 km2，总库容2.58×105 m3，正常库容1.57×103 m3，最高水位34 m（珠基），有效最低水位27.4 m（珠基）。
1.1.2 采样点设置与采样频率
在大沙河水库敞水区设置采样点，从2016年8月—2017年8月，每月采样1次。
1.1.3 样品采集与处理
用YSI水质仪现场测定水温（T）、pH值，用黑白盘（塞氏盘）测定透明度。采集表层0.5 m的水样按照国家水质监测标准方法（GB 3838—2002）测定总磷（TP）、总氮（TN）、硝态氮（NO3--N）和氨氮（NH3-N）、正磷酸盐（PO43--P）的浓度，用ICP-AES法测定总铁（TFe）和溶解性铁（DFe）浓度。
用采水器采集水样后，取1 L水样现场加入1%鲁哥试剂，带回实验室，取10 mL水样，采用倒置显微镜镜检法对浮游植物进行种类鉴定和计数，每个样品至少计数400个藻类个体。
1.2 室内实验
1.2.1 藻种来源与培养
实验所用藻种拟柱孢藻（C. raciborskii，N8）分离自广东省江门市镇海水库；角星鼓藻（Staurastrum sp.，FACHB-1449）购自中国科学院武汉水生生物研究所，分离自一座亚热带富营养化水库——湖北赤壁陆水湖水库，为热带亚热带常见种。将N8和FACHB-1449置于BG11培养基中培养，培养条件为：温度25.5±1℃，光强35 μmol/（m2·s），光照周期12 h:12 h。
1.2.2 培养条件及实验设计
以BG11培养基为基础（Fe3+浓度为0.689 mg/L），以柠檬酸铁铵为铁源，依据热带水库湖上层的铁浓度范围（< 0.3 mg/L），共设置三种铁浓度实验组：0.689 mg/L（IPHFe，即BG11对照组），0.29 mg/L（IPMFe），0.029 mg/L（IPLFe）；将BG11磷源替换为有机磷（OP，D-葡萄糖-6-磷酸），以柠檬酸铁铵为铁源设置有机磷源条件下三种铁浓度实验组：0.689 mg/L（OPHFe），0.29 mg/L（OPMFe），0.029 mg/L（OPLFe）。每个藻株各有六个实验组（IPLFe、IPMFe、IPHFe、OPLFe、OPMFe和OPHFe），每个实验组设置三个平行。
将预培养的藻液接种至不含铁、磷的BG11培养基，饥饿培养3天后，将饥饿处理后的藻液分别接种至各实验组培养基中，接种叶绿素a的初始浓度为17.90±1.95 μg/L。培养条件为：温度25.5±1℃，光强35 μmol/（m2·s），光照周期12 h:12 h。采用丹麦Biosense公司的oCelloScope微生物生长动态监测系统进行非侵入式在线监测，该系统通过数字成像与图像分析技术实时获取各实验组培养体系的相对浊度与生物量动态曲线，用以判定藻细胞进入对数生长期的时间节点并连续追踪生长轨迹；每隔1天或3天于上午11点取样，采用TrilogyTM Fluorpmeter荧光仪测定叶绿素a浓度，并取1 mL藻液加鲁哥试剂保存用于细胞计数，同时测定碱性磷酸酶活性和铁载体产量。
1.2.3 指标测定
1）生长曲线和比生长速率的计算
基于oCelloScope系统实时监测所得的相对浊度动态数据判定藻细胞进入对数期，取样后遮光处理20 min，用TrilogyTM Fluorpmeter荧光仪测定藻液叶绿素a荧光值，根据标准曲线换算成叶绿素a浓度（Chl.a浓度）；取100 μL藻液于生物计数框中，采用视野法计数，并计算藻细胞密度。比生长速率计算公式为：
μ = [ln(C2) − ln(C1)] / (t2 − t1)
式中，C1和C2分别代表时间t1和t2时的细胞密度（cells/L）。
2）铁载体的测定
参考相关测定方法，藻液离心后取上清液（s）1 mL，加入1 mL CAS分析溶液和20 μL 0.2 mol/L 5-磺基水杨酸，摇匀，以不含铁的BG11培养基作对照（r）。将样品（s）和对照（r）与CAS的混合液在室温下避光放置1 h后，于630 nm处测定吸光值（A）。铁载体产量的计算公式为：
铁载体产量 = (Ar − As) / Ar
铁载体产量低于0.01时被认为是无铁载体产生，以单位浓度Chl.a的铁载体产量用于数据分析。
3）碱性磷酸酶活性的测定
碱性磷酸酶活性测定方法为分光光度比色法。参考碱性磷酸酶活性检测试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）的步骤，采用酶标仪于405 nm处测定对硝基苯酚的吸光值，计算单位时间内每微克叶绿素a产生的对硝基苯酚的量，以此表示细胞碱性磷酸酶活性（μmol/（μg Chl.a）·min）。
1.3 统计分析
水库中拟柱孢藻和角星鼓藻生物量和相对生物量与环境因子的关系，采用多元逐步回归方法分析各因子对生物量和相对生物量变化的解释量及回归关系。
采用单因素方差分析（One-way ANOVA），比较相同磷源条件下三个铁浓度实验组的Chl.a浓度、藻细胞密度以及比生长速率的差异；采用双因素方差分析（Two-way ANOVA），分析磷源、铁浓度以及两者交互作用对比生长速率、碱性磷酸酶活性和铁载体产量的影响。显著性水平均设定为P < 0.05。