养猪场黑曲霉对三唑类和棘白菌素类药物的耐药现象
三、结果
3.1 真菌物种
从沉积粉尘、粪便物质、稻草材料和空气粉尘样本中，从37摄氏度下培养的354株真菌分离株中总共培养出43株曲霉菌分离株。培养的其他真菌包括念珠菌属、 Lichtheimia、 Rhizomucor、 Trichosporon和 Scopulariopsis属的成员。
培养的曲霉属物种被鉴定为白曲霉、烟曲霉、灰绿曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、土曲霉和杂色曲霉。来源材料最多样化的是沉积粉尘（五种），其次是稻草（四种）、空气粉尘（三种）和粪便物质（一种），如图1所示。6月19日采集的粪便物质、沉积粉尘和稻草样本中含有白曲霉、烟曲霉、构巢曲霉和杂色曲霉。7月3日采集的样本中，从沉积粉尘和稻草中培养出白曲霉、灰绿曲霉和杂色曲霉。7月17日采集的样本中，从空气粉尘、沉积粉尘、粪便物质和/或稻草中培养出白曲霉、烟曲霉、灰绿曲霉、构巢曲霉、黑曲霉和土曲霉。
图1. 从四种采样材料中培养的曲霉菌分离株的物种和数量分别在x轴和y轴上显示。每根柱子着色代表分离株收集的材料：紫色：空气粉尘（n=6）；蓝色：粪便物质（n=15）；绿色：沉积粉尘（n=15）；黄色：稻草（n=12）。
3.2 耐药性特征
发现对所有测试抗真菌药物均存在耐药性，27.9%的分离株对至少一种抗真菌药物表现出耐药性，11.6%的分离株对多种抗真菌药物表现出耐药性。
在本研究发现的7种曲霉属中，黑曲霉表现出最大的抗真菌耐药性，10/43（23.3%）分离株对伊曲康唑、伏立康唑和卡泊芬净表现出耐药性。土曲霉和杂色曲霉均对两性霉素B表现出耐药性，如图2所示，因为它们的MIC值超过了临床折点。
六株黑曲霉对伊曲康唑耐药（MIC≥2mg/L伊曲康唑），九株对伏立康唑耐药（MIC≥2mg/L伏立康唑）。一株灰绿曲霉和两株杂色曲霉对两性霉素B的MIC升高（MIC≥2mg/L两性霉素B），而三株黑曲霉对卡泊芬净的MEC较高（MEC≥16mg/L卡泊芬净）。三株黑曲霉对伊曲康唑、伏立康唑和卡泊芬净表现出多重耐药性（图2），因为它们的MIC和MEC值高于烟曲霉的ECOFF。
图2. 每个曲霉菌分离株（n=43）对（A）伊曲康唑、（B）伏立康唑、（C）两性霉素B和（D）卡泊芬净的最低抑菌浓度（MIC）和最低有效浓度（MEC）。每个点代表单个分离株对测试抗真菌药物的MIC或MEC。不同符号代表不同的曲霉属物种（方块：白曲霉；圆圈：烟曲霉；三角形：灰绿曲霉；十字：构巢曲霉；叉号：黑曲霉；菱形：土曲霉；倒三角形：杂色曲霉）。
3.3 潜在矛盾耐药性
15株黑曲霉中有6株表现出对伊曲康唑的矛盾耐药性迹象，因为它们在抗真菌药物浓度增加时显示出生长的自发恢复。这种效应如图3A所示，其中OD600测量显示在临床折点以上浓度（2mg/L伊曲康唑）时生长自发开始。
六株黑曲霉对伊曲康唑耐药（MIC≥2mg/L伊曲康唑），九株对伏立康唑耐药（MIC≥2mg/L伏立康唑）。一株灰绿曲霉和两株杂色曲霉对两性霉素B的MIC升高（MIC≥2mg/L两性霉素B），而三株黑曲霉对卡泊芬净的MEC较高（MEC≥16mg/L卡泊芬净）。三株黑曲霉对伊曲康唑、伏立康唑和卡泊芬净表现出多重耐药性（图2），因为它们的MIC和MEC值高于烟曲霉的ECOFF。
对六株黑曲霉中的一株进行了扩展浓度伊曲康唑的生长分析，使用oCelloScope系统。在该分离株中，发现伊曲康唑浓度的进一步增加导致生长减少（图3B）。
图3.（A）显示六株潜在表现出矛盾耐药性的黑曲霉生长量的平均光密度（OD600）。OD600在与不同浓度（0-8.0mg/L）伊曲康唑孵育两天后读取。箱线图以中位数划分四分位距（IQR）；须线延伸至箱线外1.5×IQR。单点用于指示潜在异常值。（B）在48小时后测量的分割提取表面积（SESA）标准化值，显示一株黑曲霉在伊曲康唑浓度范围为0至64.0mg/L挑战下产生的生物量。
四、讨论
全球范围内，对医学抗真菌药物耐药的曲霉菌临床分离株数量正在增加。这非常令人担忧，因为据估计每年约有20万人死于侵袭性曲霉病。尽管已知抗真菌耐药性在临床和农业环境中都在增加，养猪场工人暴露于高浓度的真菌，并且可能是抗生素耐药微生物的来源，但来自养猪场的曲霉属环境分离株的耐药性特征尚未得到充分研究。
在本研究中，空气传播和非空气传播的真菌均对抗真菌药物耐药，并且在所有采样日均被检测到。因此，在收集的粪便物质、沉积粉尘和稻草中，以及空气样本中，均发现了抗真菌耐药分离株。这令人担忧，因为猪舍中的工人可能吸入空气传播的粉尘，此外，高压清洗被粪便和沉积粉尘污染的表面可以使微生物气溶胶化，而稻草在处理过程中可以释放包括孢子在内的空气传播颗粒。先前关于沉降粉尘微生物背景的研究表明，相当比例的细菌和真菌物种与猪的胃肠道相关。因此，猪舍中很大比例的生物气溶胶可能来源于猪的粪便物质。除了微生物可能变为空气传播外，处理含有致病性真菌（如黑曲霉）的材料已被证明会导致职业性甲感染的发展。在我们的研究中，我们收集了超过300株致病性真菌分离株，包括曲霉属、念珠菌属、 Lichtheimia、 Rhizomucor、 Trichosporon和 Scopulariopsis属，所有这些属都包含已知的人类病原体或新兴病原体。在三个采样日收集的每个属的分离株数量概述见补充图S2。在这些属中，我们重点关注曲霉属内的抗真菌耐药性，发现超过25%的测试分离株对至少一种药物耐药。
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