基于无标记生长动力学的宽口裂腹鱼中肾细胞系建立与培养条件优化
摘要： 宽口裂腹鱼(Schizothorax eurystomus)为塔里木河水系土著鱼类、新疆特有经济鱼类，受人为活动与环境变化影响，野生资源急剧衰退，已被列入拟保护名录。为保存其种质资源并为细胞生物学、环境毒理学与基因工程研究提供实验材料，本研究以采自新疆克孜勒河的宽口裂腹鱼中肾组织为材料，采用组织块移植法启动原代培养，经传代驯化建立细胞系，并引入丹麦 BioSense 微生物生长动态监测系统(oCelloScope)替代常规血球计数板计数、MTT 比色法与显微成像系统，对其培养条件与生长动力学进行无标记、原位、连续测定。结果表明，组织块于培养第 4 天开始迁出细胞，第 9 天铺满约 70% 瓶底，第 15 天呈悬浮生长并按 1∶2 传代。条件优化结果显示，最适培养基为 DME/F-12，最适培养温度为 25 ℃，最适胎牛血清(FBS)浓度为 20%。在该条件下细胞生长曲线呈"S"型，第 4 天达峰值，群体倍增时间为 23.26 h。第 6 代细胞经液氮冻存 6 个月后复苏，台盼蓝染色并经 oCelloScope 成像计数，存活率达 91.91%，复苏细胞增殖活跃且可正常传代。PCR 检测未检出细菌、真菌及支原体污染。基于 16S rRNA 基因扩增获得 1077 bp 片段，与 GenBank 中宽口裂腹鱼线粒体基因(NC0369331)序列同源性为 99.81%，确证细胞来源。本研究成功建立宽口裂腹鱼中肾组织细胞系，为该濒危物种的种质资源保护与后续研究奠定基础。
引言
宽口裂腹鱼(Schizothorax eurystomus)隶属鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、裂腹鱼亚科(Schizothpracinae)、裂腹鱼属(Schizothorax)，民间俗称白条(龙见全等, 2019)。该种下颌具角质，手触有明显粗糙感，构成野外识别与采样的直观形态依据。
在地理分布上，宽口裂腹鱼属跨境分布类群。国外见于阿姆河水系与锡尔河水系；国内分布于阿克苏河、渭干河、叶尔羌河、克孜勒苏河及伊犁河。作为塔里木河水系的土著鱼类，它同时兼具新疆特有经济鱼类的属性，其资源变动因而兼具生态与经济双重意义。
然而，受人为因素与环境变化影响，宽口裂腹鱼种群数量急剧减少。在自然环境中，其产卵的受精率与成活率均不高，种群自然补充能力本就偏弱。
2019 年 4 月，研究者在乌恰县境内克孜勒河采集到体长约 6 cm 的个体，按压腹部可见泄殖孔流出大量乳白色精液。体长 6 cm 以下的个体同样可挤出精液，表现出不同程度的早熟现象。小型个体的普遍性早熟，通常是对种群衰退与生存压力的响应，从侧面反映出野生资源的退化程度。环境变化、气候变化与栖息地破坏，进一步加剧了裂腹鱼类的濒危态势(魏杰等, 2020)。
市场端的表现同样印证资源萎缩。目前市场上宽口裂腹鱼已属少见，价格达 200~400 元/kg。资源量的持续下降，已促使新疆维吾尔自治区拟将其列为保护鱼类(龙见全等, 2019)。
细胞培养技术是指在体外人工模拟体内环境的培养基中，使细胞经大量培养成为简单单细胞或极少分化多细胞的技术。该技术将生命过程由完整个体简化至可在培养容器中操作与观测的层面，为濒危物种的遗传资源保存提供了不依赖活体个体存续的技术路径。
世界上第一个鱼类细胞系由 Wolf 等(1962)建立，为虹鳟(Oncorhynchus mykiss)生殖腺细胞系 RTG-2。我国最早建立的鱼类细胞系由张念慈等(1981)报道，为草鱼(Ctenopharyngodon idellus)吻端组织细胞系 ZC-7901 及其上皮样细胞亚株 ZC-7901S1。
迄今，鱼类细胞培养相关细胞系的报道已涉及 34 科 80 种 300 株(Fryer et al, 1994)。这些细胞系已被广泛应用于病毒学、免疫学、细胞生物学、基因工程和环境毒理学等领域。
鱼类细胞培养的材料来源十分广泛。已有报道包括斑点叉尾(Ictalurus puncatatus)肾脏细胞系 CCK(徐进, 2012)、赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)鳍条细胞系 SCF(邓亚林, 2016)、条斑星鲽(Verasper moseri)卵巢细胞系 BFO(Xu, 2015)，以及斑石鲷(Oplegnathus punctatus)肌肉、脑细胞系(王梦珂等, 2018)。上述研究提示，鱼类细胞系的建立并无统一的取材标准。肾脏、鳍条、卵巢、肌肉、脑等组织均可作为培养起点，其可行性取决于细胞能否在体外实现稳定增殖。其中，肾组织因细胞活性较好、取材相对便利，近年来受到较多关注。研究者已围绕大黄鱼(Pseudosciaena crocea)(郑在予等, 2017)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)(赵建青等, 2019)、松江鲈(Trachidermus fasciatus)(单莉娟, 2015)、草鱼(左文功等, 1984)及金钱鱼(Scatophagus argus)(张莹莹等, 2014)的肾组织建立细胞系并分析其生物学特性。
在细胞系培养条件的评价环节，传统方法多依赖血球计数板人工计数、MTT 比色法测定 OD 值或显微观察。这些方法存在取样破坏性大、时间分辨率低、易引入操作误差与污染风险等固有局限，且对悬浮生长细胞的取样计数尤为不便。近年来出现的无标记活细胞成像技术为上述问题提供了新的解决方案。丹麦 BioSense Solutions 公司推出的 oCelloScope 微生物生长动态监测系统，采用专利 FluidScope™ 倾斜光学扫描技术，光轴相对微孔板水平面倾斜 6.25°，通过 Z 轴层切成像重建样品的三维体积信息；全程无需染色、标记或样品预处理，可在培养箱内对 6~96 孔板中的液体样品进行原位、连续、自动化时序扫描。该系统适配 6~96 孔平底微孔板，样品体积 35~300 μL，96 孔板全板最快扫描时间约 2 min 26 s，主机可直接置于培养箱内运行(工作温度 20~40 ℃，工作湿度 20%~93% RH)，有效规避了传统方法中反复取出培养板进行人工取样计数所导致的温度波动与生长节律扰动。其内置 BCA(背景校正吸收)、TA(总吸收)与 SESA(静态杂质过滤)算法，其中 BCA 算法以图像分割区分目标物像素与背景，可剔除培养基析出物、气泡、碎屑等非生物杂点，检测灵敏度约为传统 OD 浊度法的 250 倍，可自 10³ 目标物/mL 起检出，并同步输出生长动力学曲线与细胞面积、周长、圆度、长宽比等形态学参数，光学分辨率达 1.3 μm，可检测 0.5 μm~1 mm 目标物。上述特性与宽口裂腹鱼中肾细胞的悬浮生长特性高度契合，亦与本研究在多档温度梯度(20~30 ℃)下于培养箱内连续监测的需求适配。
截至目前，宽口裂腹鱼细胞系的建立尚属空白。本研究以宽口裂腹鱼中肾组织为材料，采用组织块移植法启动原代培养，引入 oCelloScope 系统替代传统计数与比色手段，系统优化培养条件并分析其生物学特性，旨在为该濒危物种的种质资源保护、环境毒理学评价及基因工程研究奠定基础。
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