宽口裂腹鱼中肾组织细胞系的建立、冻存复苏及 16S rRNA 来源鉴定
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验用鱼于 2019 年 4 月采自新疆克孜勒河。选取其中 1 条健康个体用于细胞培养，其体重为 93.98 g，体长为 15.89 cm，全长为 18.66 cm。供体的健康状态与规格直接影响原代培养的成败。本研究所选个体规格较大，可保证中肾组织的取材量，并降低因组织量不足导致培养失败的风险。
培养基 DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640 和 M199 购自 Hyclone 公司；胎牛血清(FBS)购自 Gibco 公司。磷酸缓冲液(PBS)、青霉素–链霉素双抗、二甲基亚砜(DMSO)和吉姆萨购自 Solarbio 公司。台盼蓝与 0.25% 胰酶购自 Biotopped 公司。麻醉剂 MS-222 购自渔夫宝公司。25 cm²和 75 cm²细胞培养瓶、15 mL 和 50 mL 离心管、移液管、细胞冻存管、24 孔和 96 孔细胞培养板均为 Corning 公司产品。基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。其余化学试剂均为分析纯。
主要仪器为丹麦 BioSense Solutions 公司(BioSense Solutions ApS, Farum, Denmark)的 oCelloScope 微生物生长动态监测系统，配套 UniExplorer 控制与分析软件。该系统采用 FluidScope™ 倾斜光学扫描技术(光轴相对微孔板水平面倾斜 6.25°，通过 Z 轴层切成像重建样品三维体积信息)，光学分辨率 1.3 μm，可检测 0.5 μm~1 mm 目标物；固定透镜光学放大 4×，数码放大最高 200 倍，配 5 Mpx CCD 相机；适配 6~96 孔平底微孔板，样品体积 35~300 μL；96 孔板全板最快扫描约 2 min 26 s；主机可直接置于培养箱内运行(工作温度 20~40 ℃，湿度 20%~93% RH)；无需染色、标记或样品预处理；内置 BCA、TA 与 SESA 三种图像分析算法，BCA 灵敏度约为传统 OD 浊度法的 250 倍，可自 10³ 目标物/mL 起检出，并同步输出生长动力学曲线与形态学参数(细胞面积、周长、圆度、长宽比等)。本研究中所有细胞计数、生长曲线测定与活细胞形态成像均由该系统完成。
试剂来源与纯度级别的统一，有助于控制批次差异，保障实验的稳定性与可重复性。
1.2 实验方法
1.2.1 供试鱼的无菌预处理
鱼类组织携带大量微生物，原代培养一旦污染，前期工作将全部作废。本研究的预处理流程围绕"彻底除菌、保留组织活性"这一核心矛盾设计。
第一步为暂养。将宽口裂腹鱼于实验室暂养 3 d，使其排出部分消化道内容物及体表附着物，并适应实验室水体环境。第二步为体表消毒。将鱼置于 20 mg/mL KMnO₄溶液中浸泡 30 min，通过氧化作用杀灭体表微生物。第三步为麻醉致死。按 0.1 μL/g 的剂量加入 MS-222 麻醉剂，使鱼麻醉并致死。第四步为无菌取材环境的建立。将鱼全身喷涂 75% 酒精后，置于超净台的解剖盘中。第五步为取材容器准备。取 4 个培养皿，其中 1 个加入 75% 酒精，另 3 个均加入含 500 IU/mL 青霉素、500 μg/mL 链霉素和 12.5 μg/mL 两性霉素 B 的 PBS。三种抗生素组合覆盖了细菌与真菌两大类污染源。第六步为解剖取材。以解剖学方法取出鱼鳔之上、脊柱下侧的中肾组织。第七步为梯度消毒漂洗。将中肾组织置于 75% 酒精中浸泡 30 s，随后依次转入另外 3 个含 PBS 的培养皿中浸泡，后续三次 PBS 漂洗既稀释残留酒精，又通过抗生素进一步清除微生物。第八步为组织剪切。将处理后的中肾组织转入 2 mL 无菌离心管，用无菌眼科剪剪成 1~3 mm 大小均匀的组织碎块，该尺寸区间既保证内部细胞的营养与氧供应，又避免过小导致的机械损伤与细胞量不足。
1.2.2 原代培养与传代培养
将剪好的组织碎块移入 25 cm²细胞培养瓶，置于 25 ℃ CO₂培养箱中观察贴壁情况。培养 4 h 后将培养瓶反相放置，使组织块在少量液体条件下与瓶壁充分接触，避免过早加入大量培养液导致组织块浮起。6 h 后加入 1 mL 含 20% FBS、500 IU/mL 青霉素、500 μg/mL 链霉素和 500 μg/mL 两性霉素 B 的 DME/F-12 培养液，正相置于 25 ℃、5% CO₂培养箱中培养。初始培养液采用高血清、高抗生素配置，以满足培养初期细胞的营养需求与无菌保障。培养期间每日观察组织生长情况。2~3 d 后更换培养液，以补充营养并移除代谢废物。当组织块周围出现细胞悬浮物时启动收集。将悬浮细胞移入 15 mL 离心管，1000 r/min 离心 5 min，弃上清后加入 PBS 重悬，再次以 1000 r/min 离心 5 min，如此重复 3 次，以彻底去除残留血清、抗生素及组织碎屑。洗涤后加入 DME/F-12 培养液，按 1∶2 比例进行传代培养。传代过程中实施梯度驯化。第 5 代之后，将培养液中链霉素、青霉素和 FBS 浓度分别调整为 200 μg/mL、200 IU/mL 和 15%。至第 8 代，培养液更换为含 10% FBS 和 1% P/S 的 DME/F-12 培养液，使细胞由强干预下的存活过渡至常规条件下的稳定生长。
1.2.3 最适培养基筛选
选用 DME/F-12、M199、L-15、MEM 和 RPMI-1640 五种培养基，分别加入 10% FBS 和 1% P/S，混匀。取等量的中肾细胞分别接种于上述 5 种培养基中，接种细胞数量保持一致。因 oCelloScope 适配 6~96 孔平底微孔板，本实验及各条件筛选实验均将细胞接种于 96 孔培养板，每孔 200 μL，每种培养基设 3 个复孔。接种后将 96 孔板置于 25 ℃、5% CO₂培养箱内的 oCelloScope 载台上，按设定时间间隔自动扫描。系统无需取样、无需消化、无需染色，直接对孔内悬浮细胞进行原位成像，并由 BCA 算法生成背景校正后的生长动力学曲线。分别在培养 0、24、48、72 和 96 h 读取各孔细胞浓度，绘制 5 种培养基中的细胞生长曲线。
1.2.4 最适温度筛选
设置 20 ℃、25 ℃和 30 ℃三个温度梯度，观察温度对中肾细胞生长的影响。各温度组均采用含 10% FBS 和 1% P/S 的 DME/F-12 培养基。将等量细胞接种于 96 孔培养板，每孔 200 μL，每组设 3 个复孔，分别置于对应温度的培养箱中，由该培养箱内的 oCelloScope 完成时序扫描。由于 oCelloScope 主机工作温度为 20~40 ℃，三档温度均处于其允许工作区间内，系统在培养箱内连续运行，避免了传统方法中反复取出培养板进行人工取样计数所导致的温度波动与生长节律扰动。于培养 0、24、48、72 和 96 h 读取细胞浓度，绘制不同温度下的生长曲线。
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