揭示母乳抗菌新机制：XO-LPO系统对口腔细菌糖酵解和氧化应激基因的调控
摘要
黄嘌呤氧化酶（XO）和乳过氧化物酶（LPO）是牛奶中含量极为丰富的酶。它们的底物黄嘌呤和硫氰酸盐在婴儿唾液中含量较高，由此提出了一种称为XO-LPO系统的牛奶与唾液之间的相互作用。该系统被认为能够产生活性氧和氮物种，具有潜在的抗菌作用。本研究评估了XO-LPO系统对从五名婴儿口腔中培养的细菌的抗菌活性，观察到在每种酶浓度为40 μg mL⁻¹时细菌生长速率降低，在200 μg mL⁻¹时完全抑制。基因表达分析显示，XO-LPO处理导致多个活性氧相关基因下调，表明存在短暂的细菌应激反应。研究还观察到关键糖酵解酶的下调，表明XO-LPO处理在转录水平上影响细菌代谢，提示了XO-LPO系统可能的作用机制。总之，这些发现为XO-LPO系统提供了新的见解，揭示了泌乳与微生物组相互作用的新方面。
1. 引言
人体微生物群是共存于身体不同部位的微生物（细菌、真菌、古菌和病毒）的共生群落。肠道微生物群研究最为广泛，对维持人体健康至关重要。然而，鉴于口腔微生物群是第二大微生物群落，应给予更多关注，并关注调节它的因素。微生物组研究的进展揭示了口腔微生物与慢性疾病之间的联系，口腔微生物群的变化反映了全身健康状况，从而提供了疾病的潜在早期指标。目前，人类口腔微生物组数据库列出了口腔中的774种口腔细菌物种，其中厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和梭杆菌门是主要门类。口腔环境由于直接暴露于外部因素，比相对稳定的胃肠道更易变，增加了受外部变化影响的可能性。
微生物群的发育始于出生时，甚至可能在子宫内，婴儿从母体部位和环境中获取微生物。分娩方式、胎龄、出生体重、抗生素使用和饮食等因素影响这种早期定植模式。母乳喂养进一步改变微生物群组成，虽然母乳长期被认为是无菌的，但已发现其拥有自身独特的微生物组。2016年，16S rRNA基因测序揭示了纯母乳喂养与配方奶喂养婴儿口腔微生物群的差异。尽管有这些发现，微生物群发育的潜在机制仍不清楚。除了细菌的存在，母乳还含有多种化合物，包括聚糖、免疫球蛋白和非免疫蛋白如乳铁蛋白、溶菌酶和乳过氧化物酶（LPO），它们可能因其抗菌特性而影响细菌组成。
虽然较少被确认，但牛奶中另一种具有潜在抗菌特性的蛋白质是黄嘌呤氧化酶（XO）。其抗菌活性首次在1943年被探索，当时从牛乳中分离的XO被发现能抑制金黄色葡萄球菌的生长。此后，在各种条件下牛奶中XO的分离、活性和存在已被研究和讨论。XO是一种广泛表达于哺乳动物组织中的酶，催化嘌呤分解代谢的最后步骤，将次黄嘌呤转化为黄嘌呤，再转化为尿酸，在氧化条件下产生过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（O₂·⁻）作为副产物。尽管由于牛奶中缺乏其底物，XO在牛奶中的酶促作用长期受到质疑，但其潜在的抗菌作用最近被重新审视。一项研究发现新生儿唾液中黄嘌呤和次黄嘌呤浓度升高，由此推测当牛奶中的XO在母乳喂养期间遇到唾液中的底物时可能产生的影响。随后的研究证实这种相互作用可以抑制细菌生长，抗菌活性归因于XO，这通过使用XO抑制剂的对照试验得到了证明。然而，XO独立发挥抗菌作用的能力存在争议。有研究表明，XO产生的H₂O₂被LPO利用以产生强效抗菌物质来抑制细菌生长。最近一项研究发现，只有当LPO及其底物（黄嘌呤和硫氰酸盐）也包含在内时，XO的抗菌作用才存在，去除任何成分都会消除对大肠杆菌生长的抗菌作用。XO和LPO之间的这种相互作用被称为XO-LPO系统，如图1所示。该系统可能产生各种活性氧和氮物种（ROS、RNS），通过诱导氧化应激来对抗细菌。虽然需要进一步研究，但该系统可能为母乳喂养与配方奶喂养婴儿口腔微生物群的差异提供解释。
由于XO-LPO系统可能产生具有不同效力和特异性的各种抗菌物质，它可能以不同方式影响口腔中的细菌物种，受细胞壁组成和过氧化氢酶活性等因素影响。为了减少有害ROS反应，细菌已开发出多种对抗氧化应激的机制，包括清除酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶，以及SoxRS、OxyR和PerR系统等基因的诱导。
本研究旨在调查XO-LPO系统对从婴儿口腔中培养的细菌的影响。使用XO和LPO的组合进行了剂量依赖性细菌生长试验以评估效力。此外，本研究评估了XO-LPO系统对细菌组成和基因表达的影响。了解该系统可能揭示其抗菌活性的新特征，并为泌乳与微生物组影响之间的相互作用提供新见解。
2. 材料与方法
2.1 乳过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶的分离
LPO从丹麦荷斯坦奶牛的新鲜未加工散装牛奶中分离。分离程序基于现有方案，并进行了若干修改。所有离心步骤均在4600×g和4 °C下进行。通过离心获得的脱脂牛奶酸化至pH 3.5，离心15分钟，通过粗棉布过滤收集乳清上清液。通过加入硫酸铵（40% w/v）并在冰上混合2小时实现乳清蛋白沉淀，随后离心45分钟。所得沉淀重悬于10 mM乙酸铵（pH 5.5）中，混合2小时后于去离子水中透析过夜。第二天，将透析管转移至5 mM乙酸铵（pH 5.5）中进一步透析过夜。
第二天，样品离心60分钟，上清液加载到二乙氨基乙基（DEAE）Sepharose Fast Flow阴离子交换柱（GE Healthcare，瑞典）上，使用0.02 M至0.25 M的线性乙酸铵梯度，pH 5.0。收集含LPO的流穿液，并将pH调整至5.0。然后将该样品加载到羧甲基（CM）纤维素阳离子交换柱（GE Healthcare，瑞典）上，使用0.02 M至1.5 M的线性乙酸铵梯度，pH 5.0。
测量洗脱组分的吸光度，波长为280 nm和412 nm，并对选定组分进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。基于A₄₁₂/A₂₈₀比值和SDS-PAGE结果，将含LPO的组分合并，并通过0.2 μm膜过滤器无菌过滤，然后储存于−70 °C。使用Micro BCA蛋白检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）按照制造商建议测定LPO分离程序选定样品的蛋白质浓度。通过使用Multiskan GO微孔板分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）进行紫外-可见光谱扫描评估最终LPO分离物的纯度。
XO按照先前描述的方法从牛乳的奶油部分分离。该过程包括丁醇提取和酪乳蛋白沉淀，随后进行离子交换色谱和尺寸排阻色谱。
2.2 蛋白质印迹分析
SDS-PAGE后，蛋白质通过湿转移（500 mA和200 V）转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜用含2% Tween 20（v/v）的Tris缓冲盐水（50 mM Tris，0.5 M NaCl，pH 7.4）封闭，并于4 °C与绵羊抗牛LPO（5 μg mL⁻¹，RDI，美国）孵育过夜。第二天，膜与兔抗绵羊辣根过氧化物酶偶联物（1:1000）（Dako，德国）孵育1小时。洗涤后，膜用增强化学发光溶液（GE Healthcare，瑞典）处理，并使用ImageQuant LAS 4000显影。
2.3 乳过氧化物酶活性测定
LPO分离程序选定步骤的样品用30 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）稀释。将缓冲液和稀释样品转移至96孔板，并于37 °C加热15分钟。底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）ONE（Kementec，丹麦），包含缓冲液和H₂O₂，在测量开始前立即加入每孔（每孔100 μL）。使用Multiskan GO微孔板分光光度计在37 °C下以60次读数、11秒间隔的动力学循环测量650 nm处的吸光度。在此波长下过氧化物酶活性通过氧化TMB产物的积累来确定（Δε₆₅₀ = 39,000 M⁻¹ cm⁻¹）。
2.4 婴儿口腔接种物的收集
五名婴儿（三名女性，两名男性）的母亲签署了知情同意书，同意其婴儿参与本研究。从健康、足月、阴道分娩、年龄在15–17周且在采集前至少30分钟未进食的婴儿口腔中采集拭子。这些婴儿均为纯母乳喂养，在采样前三个月内婴儿及其母亲均未接受抗生素治疗。本研究纳入婴儿的特征总结于表1。使用无菌拭子和手套轻轻擦拭每名婴儿口腔表面约1分钟。从每名婴儿采集一根拭子，置于含2 mL脑心浸液（BHI）培养基（Sigma-Aldrich，美国）的无菌管中，并置于冰上。样品立即送至奥尔堡大学实验室，在那里所有样品合并到一个锥形瓶中，并于37 °C和180 RPM下孵育。第二天，将0.5 mL细菌培养物接种到50 mL培养基中，孵育2小时（37 °C和180 RPM）以达到对数生长期。从该悬液中进行如第2.5节和第2.6节所述的细菌生长实验以及细菌组成和基因表达实验。
表1 本研究纳入婴儿（三名女性，两名男性）的胎龄、出生体重和口腔标本采集时年龄的概述。
| 胎龄（周） | 出生体重（克） | 采集时年龄（周） | |
| 平均值±标准差 | 40±0.5 | 4046±570 | 16±0.9 |
| 范围 | 40-41 | 3250-4810 | 15-17 |
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