应用丹麦 BioSense oCelloScope 系统建立宽口裂腹鱼中肾组织细胞系
2.3 最适温度
在 20 ℃、25 ℃和 30 ℃三个温度条件下同条件培养 4 d 后，经 oCelloScope 测定中肾细胞数量(图 4)。结果显示，20 ℃与 25 ℃条件下的培养效果非常相似，而两者均明显优于 30 ℃，差异自 1 d 后开始显现。30 ℃下细胞增殖明显受抑。20 ℃与 25 ℃之间的比较更为接近。20 ℃略优于 25 ℃，但差异不显著，尤其在 2、3 d 时几乎相同。至 4 d 后出现差别，25 ℃组细胞数量略高于 20 ℃组。据此确定，宽口裂腹鱼中肾组织细胞的最适培养温度为 25 ℃。
图 4 细胞培养最适温度
2.4 最适血清浓度
将等量的中肾细胞分别置于 0%(对照组)、5%、10% 和 20% FBS 浓度的培养基中同条件培养，经 oCelloScope 连续测定。结果显示，除对照组生长较缓外，其余各浓度组细胞均生长较好(图 5)。10% 与 20% 浓度组的细胞生长数量较为接近，尤其在 1、3 和 4 d 时更为明显。5% 浓度组的生长情况明显差于其余含血清各组。除对照组外，其他各浓度组细胞生长速度均较快。综合比较 4 组数据，确定最适血清浓度为 20%。
图 5 细胞培养的最适血清
2.5 标准生长曲线与群体倍增时间
对第 10 代中肾组织细胞，采用 oCelloScope 在最适条件下连续 7 d 自动扫描计数。结果显示细胞生长曲线呈"S"型(图 6)。培养 1~4 d 时细胞生长速度较快，处于对数增长期。至 5~6 d 时生长速度放缓并趋于平稳，进入平台期。此后细胞数量下降，进入衰亡期。细胞生长于第 4 天达到峰值。此后由于空间和营养不足等原因，细胞生长开始减弱。经计算，细胞群体倍增时间为 23.26 h。
图 6 细胞生长标准曲线
2.6 细胞冻存与复苏
对第 6 代细胞进行液氮冻存，6 个月后复苏。复苏后经台盼蓝染色并由 oCelloScope 成像计数，计算存活率，重复 10 组取平均值。结果显示，冻存 6 个月后复苏存活率达 91.91%(表 2)。复苏细胞经 oCelloScope 生长动力学模块连续测定显示，细胞具有活性，且复苏后增殖速度快(图 7)，形态正常，可正常传代(图 8)。
表 2 冻存后复苏的存活率
2.7 细胞污染检测
采用 PCR 法对细菌、真菌、支原体污染进行鉴定。结果显示，样品均未出现与阳性对照组一致的条带(图 9)。据此判定，样品中无细菌、真菌、支原体，宽口裂腹鱼中肾组织细胞未被污染。
图 9 细菌、真菌、支原体 PCR 鉴定结果
2.8 细胞来源鉴定
以提取的中肾组织细胞 DNA 为模板，进行 16S rRNA 基因 PCR 扩增，获得 1077 bp 的基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测显示片段大小符合预期(图 10)。对扩增产物测序并在 GenBank 数据库中进行 Blast 比对。结果显示，该序列与 GenBank 中发布的宽口裂腹鱼线粒体基因(NC0369331)序列同源性为 99.81%。上述结果证明，所建立的细胞系来源于宽口裂腹鱼。
3 分析与讨论
3.1 细胞系建立对宽口裂腹鱼种质资源保护的意义
宽口裂腹鱼是新疆土著鱼类，20 世纪 60 年代其数量仍然可观。但受人为因素与环境变化影响，该种现已成为濒危物种。在自然环境中，宽口裂腹鱼产卵的受精率和成活率均不高，种群自然补充能力有限。加之性早熟现象的普遍出现，野生资源的退化程度进一步加深。随着种群数量的急剧下降，保护宽口裂腹鱼已刻不容缓。建立该物种的细胞系，可有效保存其种质资源，使其遗传材料不再完全依赖活体个体的存续。同时，该细胞系可为细胞生物学、环境毒理学和基因工程研究提供实验材料，为新疆特色渔业建设提供支持。
3.2 培养基筛选结果与鱼类细胞培养常规做法的差异
本研究采用 DME/F-12、L-15、RPMI-1640、M199 和 MEM 五种培养基进行宽口裂腹鱼中肾组织细胞的体外培养，经 oCelloScope 测定，DME/F-12 效果最好。这一结果与鱼类细胞培养的既有主流做法存在差异。前人研究中，鱼类细胞培养大多采用 L-15(Wang et al, 2003; Leibovitz et al, 1977; Fryer et al, 1994)。L-15 被广泛采用有其技术依据。其有效的缓冲系统可防止 pH 的过大波动，能保证细胞的长时间培养，符合鱼类细胞的生长特征。同为肾组织来源的云纹石斑鱼(Epinephelus moara)肾组织细胞系 EMK，其最佳培养基即为 L-15(Liu et al, 2018)。但该培养基并不适宜本研究的宽口裂腹鱼中肾细胞培养。本研究使用 DME/F-12 时宽口裂腹鱼中肾组织细胞生长更好，其原因可能在于不同种鱼类生长环境不同，所需营养也不同。这一结果提示，鱼类细胞培养的最适培养基不存在跨物种的普适标准。即便同为肾组织来源，物种差异亦可导致最优培养基的分化，因此必须针对目标物种进行实测筛选。此外，除 L-15 外，RPMI-1640 和 M199 等其他培养液也逐渐应用于鱼类细胞培养。本研究中这两种培养基虽非最优，但仍支持细胞生长，仅增速在 3 d 后趋于平缓。
3.3 培养温度的物种与组织差异性
大多数细胞的生长与温度密切相关。鱼类为变温动物，其细胞培养的温度范围比哺乳动物更广。本研究中，宽口裂腹鱼中肾细胞在 20 ℃~30 ℃条件下均能生长，最佳温度为 25 ℃，此时细胞生长良好、稳定。过高或过低的温度均对细胞生长产生影响。与其他鱼类的横向比较，进一步印证了温度需实测的原则。樊廷俊等(2007)研究表明，大菱鲆(Scophthalmus maximus)鳍细胞体外培养在 16 ℃~20 ℃均能生长，最适温度为 20 ℃~24 ℃。张念伟等(2017)对大菱鲆脑细胞体外培养的研究显示，其在 18 ℃~30 ℃均能生长，最适温度为 24 ℃。Wang 等(2014)对大黄鱼肾组织细胞的研究则显示，该细胞在 28 ℃时生长最好。值得注意的是，同为肾组织来源，大黄鱼肾细胞最适温度为 28 ℃，而宽口裂腹鱼中肾细胞为 25 ℃，相差 3 ℃。同一物种内部亦存在差异。大菱鲆鳍细胞最适温度为 20 ℃~24 ℃，而其脑细胞最适温度为 24 ℃。可见，不同种及同一种不同部位的细胞来源，其生长温度不尽相同。因此，在鱼类细胞培养中确定培养温度至关重要，需结合物种特性与组织来源通过实验加以确定。本研究的温度梯度为 20 ℃、25 ℃与 30 ℃，均落在 oCelloScope 主机 20~40 ℃的工作温度区间内，保证了三档条件下监测条件的一致性。
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