养猪场不同来源曲霉菌的抗真菌药物敏感性研究
烟曲霉是全球最常见的曲霉病病因。在本研究中，我们仅检测到该物种的五株分离株，均对伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B或卡泊芬净不耐药。其他最近的环境调查研究在烟曲霉中检测到抗真菌耐药性。
相比之下，黑曲霉的数量更多，并且该物种的几株分离株对测试的多种抗真菌药物类别耐药。多重耐药黑曲霉的存在应引起关注，因为尽管由黑曲霉引起的侵袭性疾病较少被描述，但它是已知的人类病原体，可以引起侵袭性曲霉病。此外，吸入黑曲霉孢子已知可诱发过敏性肺炎，并且黑曲霉孢子已被证明具有细胞毒性。
在我们的研究中，我们检测到一株从空气粉尘中分离的土曲霉，以及两株分别从沉积粉尘和稻草中收集的杂色曲霉。这两个物种都是已知的人类病原体，空气传播土曲霉的存在可能令人担忧，因为土曲霉肺部感染与易感患者的不良临床结果相关。
尽管免疫功能正常的患者发生曲霉菌感染很少见，但先前的研究表明，工人因暴露于曲霉属而增加发生气道疾病的风险。在德国的一项研究中，暴露于真菌生物气溶胶的堆肥废物工人发展为职业性过敏性支气管肺曲霉病（ABPA），使用皮质类固醇和伊曲康唑治疗。然而，如果工人暴露于多重耐药微生物（如曲霉属）并发展为感染，那么使用一线抗真菌药物（包括伊曲康唑）的正常治疗可能不足以清除感染。
在本研究中，曲霉菌分离株数量最多的采样材料是稻草，这也是唯一从中鉴定出黑曲霉的采样材料。其他研究在养猪场的空气粉尘颗粒中发现了黑曲霉。然而，本研究采样的空气量较小，因此养猪场中可能存在空气传播的孢子或黑曲霉菌丝片段，但只是未被我们的样本收集到。尽管空气粉尘样本中未检测到黑曲霉分离株，但先前研究表明，含有真菌的稻草在处理过程中可以释放真菌孢子。这从而对养猪场工人构成职业健康风险，因为他们可能在吸入空气传播孢子后发展为曲霉病，或在处理稻草后发展为甲感染。
应注意，根据EUCAST抗真菌临床折点表提供的指南，使用棘白菌素类对抗曲霉属时，没有足够的证据进行官方的EUCAST"耐药"或"敏感"分类。然而，尽管EUCAST官方指南没有给出官方的耐药或敏感分类，在本研究中，我们的三株黑曲霉似乎可以被称为卡泊芬净耐药，因为它们对卡泊芬净的耐药性处于检测上限（MEC>16mg/L卡泊芬净）。
在关于职业暴露于真菌的研究中，大多数研究集中在潜在的呼吸道沉积、微生物群落组成或霉菌毒素含量上。虽然所有这些方面对于制定准确的职业风险评估都很重要，但它们没有考虑抗真菌耐药性。因此，本研究的结果很重要，因为它们首次展示了从养猪场分离的曲霉属的抗真菌耐药性模式。先前在其他职业环境中研究抗真菌耐药性的研究集中在三唑类（伊曲康唑、泊沙康唑和伏立康唑）耐药性上。这些研究表明，三唑类耐药性广泛存在，并且包括曲霉属、链格孢属、枝孢属、金孢属、青霉属和根霉属在内的多种不同物种能够在添加三唑类的培养基中生长。在我们的研究中，我们计算了曲霉菌分离株对三唑类的个体MIC和MEC，此外还对另外两类抗真菌药物（多烯类和棘白菌素类）进行了测试，并能够证明黑曲霉分离株对多种抗真菌药物类别耐药。这令人担忧，因为致病性物种的多重耐药性与死亡率增加相关。
通常被认为对抗真菌药物敏感的真菌分离株可能违反直觉地在较高浓度的抗真菌药物范围内表现出体外生长。这被称为"鹰效应"或"矛盾耐药性"，定义为分离株能够在低浓度抗真菌药物中生长，在中间浓度被生长抑制，并在较高浓度恢复生长。除了鉴定的抗真菌耐药物种和真菌分离株外，我们观察到六株黑曲霉，尽管它们对抗真菌药物敏感，但表现出对伊曲康唑的矛盾耐药性迹象（图3A）；这种现象在曲霉属黑曲霉组中仅被描述过一次。大多数关于曲霉属和念珠菌属矛盾耐药性的研究都与棘白菌素类相关。在关于阐明棘白菌素类矛盾耐药性机制的研究中，这些研究提出细胞壁几丁质合成上调。关于曲霉对三唑类的矛盾耐药性，尚未提出机制。然而，涉及在三唑类存在和不存在下差异蛋白质表达的蛋白质组学方法可以阐明在表现出矛盾耐药性的分离株中哪些分子途径被上调或下调。
对六株潜在矛盾耐药黑曲霉分离株之一的进一步分析显示，尽管当测量OD600时，在临床折点之后有生长增加（图3A），但当使用oCelloScope测定法在伊曲康唑浓度远远超过正常临床折点时，生长显著减少（图3B）。需要对这些分离株进行进一步研究，以确定它们是否实际上是矛盾耐药的，以及可能涉及哪些分子机制。最近一项分析本研究采样期间采集的一株潜在矛盾耐药黑曲霉蛋白质组的研究显示，麦角固醇合成、外排转运蛋白和过氧化物酶表达降低发生显著变化。
总体而言，本研究表明，假设对医学抗真菌药物敏感的环境分离株表现出经典和可能的矛盾耐药性，类似于从患者临床样本中发现的。本研究提供了养猪场内多种来源存在抗真菌耐药曲霉属的证据。虽然养猪可能不会直接导致表现出抗真菌耐药性的分离株数量增加，但暴露于高浓度真菌的工人可能发展为抗真菌耐药真菌感染的风险更大。
五、结论
在所有三个采样日，抗真菌耐药真菌存在于养猪场的表面和空气中。最常被鉴定的物种——黑曲霉——的多株分离株对四种测试抗真菌药物中的三种表现出多重耐药性。这值得注意，因为它可能导致职业性真菌感染增加。此外，黑曲霉可能从农场传播出去，在易感患者群体中可能致命的侵袭性疾病。土曲霉和杂色曲霉的分离株也对两性霉素B表现出耐药性。因此，为了进行准确的职业风险评估，应鼓励职业卫生学家在其样本中测试抗真菌耐药性，首先是为了测试工人潜在暴露于抗真菌耐药真菌的情况，也是为了帮助监测农业、非农业和非医学环境中抗真菌耐药性的全球传播。
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