草鱼性腺细胞系生长曲线测定及对鲤春病毒血症病毒敏感性研究（一）
摘要：草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)是中国科学院水生生物研究所在20世纪70年代开展草鱼出血病研究时建立的一株细胞系，迄今已传至300多代，在中国鱼类病毒学研究领域发挥了重要作用。本研究采用形态学观察、细胞生长曲线测定、细胞周期测定、细胞核型分析、细胞凋亡检测、电镜观察等方法，对GCO的生长特性及鲤春病毒血症病毒(SVCV)在该细胞中的增殖特性等进行了研究。结果显示，GCO细胞的最适生长温度为25℃，在M199和MEM等细胞培养液中均能较好地生长，培养液中最适的胎牛血清浓度为10%。测定了GCO细胞系对SVCV病毒的敏感性，发现与鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞系(EPC)、肥头鲤(Pimephales promelas)细胞系(FHM)、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)胚胎细胞系(CHSE-214)等世界动物卫生组织(OIE)推荐和各检测实验室常用的鱼类细胞系相比，GCO细胞系对SVCV表现出非常高的敏感性。生长曲线、电镜观察和凋亡实验显示，SVCV能引起GCO细胞系出现明显而稳定的细胞病变，引起GCO细胞系出现凋亡，并在细胞质中大量增殖。结果表明，GCO细胞系适用于SVCV病毒的分离、检测以及病毒致病性的有关研究。GCO细胞的适宜生长温度为15-28℃，这一特点将使它可以广泛地用于多种水生动物病毒的分离。
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是中国重要的草食性淡水养殖鱼类，已经有1700多年的养殖历史，经过几十年的人工养殖，目前，草鱼的产量在世界淡水养殖鱼类中排名第一。
20世纪50年代以后，在中国草鱼养殖中暴发了一种严重的传染性疾病——草鱼出血病(Hemorrhage disease of grass carp)，引起草鱼大量死亡。在对该病病原学、流行病学和防控技术进行研究的过程中，研究人员建立了多株草鱼细胞系，如草鱼吻端细胞系、草鱼肾细胞系和草鱼性腺细胞系(GCO)(张念慈等，1981;左文功等，1986;陈燕燊，1978)等。其中，陈燕燊(1978)建立的GCO细胞系已稳定传至300多代，在淡水鱼类病毒，如草鱼出血病病毒、胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)弹状病毒、淋巴囊肿病毒等(陈立祥等，1998;张奇亚，2002)的研究中发挥了重要作用。
在检测和诊断工作中，研究人员发现GCO细胞系对鲤春病毒血症病毒(SVCV)表现出非常稳定的敏感性，并在SVCV检测的国家标准和行业标准中使用，但一直未对GCO细胞系的特性及其对SVCV的敏感性进行系统的研究和比较。本研究对GCO的生长特性、SVCV在该细胞中的增殖特性等进行了研究，以期为GCO细胞系的使用、维护和应用提供基础数据。
1材料与方法
1.1病毒、细胞、试剂和仪器
1.1.1细胞系
本研究使用的4种鱼类细胞系：GCO细胞系、鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞系(EPC)、肥头鲤(Pimephales promelas)细胞系(FHM)、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)胚胎细胞系(CHSE-214)，均为中国科学院水生生物研究所赠。
1.1.2病毒
SVCV 10/3株为英国环境、渔业及水产科学研究中心(The Centre for Environment，Fisheries and Aquaculture Science，CEFAS)实验室赠送；使用前测定病毒滴度，并将病毒悬液稀释至103 TCID50/50μl待用。
1.1.3试剂
CELL LAB ApoScreenTM Annexin V-FITC Apoptosis Kit及DNA Prep Reagent kit购自美国Beckman公司。细胞培养液均购自GIBCO(美国)，戊二醛、秋水仙素、卡诺固定液、四氧化锇、树脂包被购自美国Sigma公司。
1.2 GCO细胞系生物学特性
1.2.1 GCO细胞生长特性分析
将初始浓度为104 cell/ml的GCO细胞悬液加入到6个12孔板中，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃的培养箱中培养。在培养至第1、2、3、4、5、6、7天时，每个温度培养的细胞分别取3孔进行消化，测定细胞数量，绘制细胞生长曲线。
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