天然I9抑制剂TrI9提升里氏木霉重组蛋白产量的研究
研究背景：本研究针对里氏木霉重组蛋白生产中因胞外蛋白酶降解导致产量损失与工艺不稳定的瓶颈展开。里氏木霉分泌能力极强（优化条件下总分泌蛋白可超100 g/L），是酶制剂与精准发酵的重要工业宿主，但其会分泌天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、胰蛋白酶样及金属蛋白酶等多种蛋白酶，严重降解异源目标蛋白。敲除蛋白酶基因虽能缓解降解，却常引发生长与产孢缺陷。尤其枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶SLP2（tire2_123244）因参与正常生长发育而无法删除，成为生产蛋白酶敏感型产品的关键障碍。为此，团队提出不依赖昂贵外源抑制剂、也不损害菌株适应性的替代策略：挖掘宿主自身的天然蛋白酶抑制剂。
研究以酿酒酵母Pbi2的AlphaFold结构为探针，用FoldSeek在里氏木霉结构库中做基于结构的同源搜索，鉴定出独立编码的I9型抑制剂TrI9（trire2_122168），其与Pbi2结构同源但序列一致性有限。随后结合AlphaFold3复合物预测、AlphaFold2-multimer片段化作图、界面置信度指标（ipSAE_min、界面PAE）与PyRosetta结合自由能计算，并经体外验证，证明TrI9可作为多靶点抑制剂，有效抑制包括SLP2在内的多种SLP。在应用层面，团队以已删除11个分泌蛋白酶的里氏木霉为底盘，导入cbh1启动子调控、CBH1融合的蜘蛛丝蛋白CBM-AQ12-CBM表达盒，进一步过表达TrI9，通过XYN2载体或HFB1信号肽引导其分泌，并以CRISPR-Cas9构建缺失株、RT-qPCR确认过表达。在工业相关条件的Ambr生物反应器中，分泌型TrI9显著降低胞外总蛋白酶活性，成功实现高度蛋白酶敏感的蜘蛛丝样蛋白CBM-AQ12-CBM的生产，提升产物完整性与工艺鲁棒性。该研究揭示了真菌SLP活性调控的新层次，为精准发酵平台提供可推广的菌株改良思路，应用可拓展至蛋白基材料、制药、酶制剂及食品等领域。。
丹麦Biosense微生物生长动态监测系统的应用
将各菌株接种于 96 孔板（每菌株 8 个复孔），每 2 小时自动成像、连续监测 64 小时，并用配套 UniExplorer 软件计算延滞期时长、指数期生长速率、50% 孢子萌发时间和总生长量（AUC）四项动力学参数，随后在 R v4.5.1 中以 Welch's 单因素方差分析配合 Games–Howell 事后检验判定差异显著性。研究者用ocelloScope设备横向比较亲本株、slp2 缺失株、TrI9 过表达株与 TrI9 缺失株，明确了两组关键对照：slp2 缺失株在全部四项指标上均显著劣化——指数期生长速率下降、延滞期延长、萌发变慢、总生长量降低（p<0.01），且镜检显示孢子形态不规则；而 TrI9 过表达株与缺失株的萌发和生长行为总体与亲本株相当，唯一显著差异仅为 XYN2 载体型 TrI9 株的 50% 萌发时间延长，所有 TrI9 株的总生长量（AUC）与亲本相比均无显著差异，PD 平板上的产孢表现也无明显区别。oCelloScope 在论文中承担的并非单纯的形态观察，而是把"过表达 TrI9 会不会拖累菌体"这一工程化关键担忧转化为可统计、可复现的高通量动力学数据，与生物反应器中的底物消耗、CER 和生物量（反射光）曲线相互印证，最终支撑了讨论与结论的核心判断：基于天然抑制剂的蛋白酶调控在保留 SLP2 等必需蛋白酶生理功能的同时抑制胞外降解，规避了基因敲除带来的生长与产孢缺陷，是一种不牺牲菌株适应度的可行替代方案。
实验结论
本研究发现TrI9是一种天然的糜蛋白酶样蛋白酶抑制剂，可用于减少T. reesei细胞外的蛋白水解。TrI9可抑制SLP2及多种相关丝氨酸蛋白酶，并在不出现slp2缺失所导致的生长和孢子形成缺陷的情况下，提高对蛋白酶高度敏感的CBM-AQ12-CBM蛋白的产量。结果表明，基于抑制剂的蛋白酶调控可能为蛋白酶基因敲除或化学抑制剂补充提供一种可行的替代方案。尽管仍需进一步优化TrI9的分泌、稳定性和工艺条件，但该策略为提升真菌细胞工厂中蛋白酶易失活重组蛋白的生产提供了有前景的途径。
图1、TrI9 抑制多种镰刀菌属（T. reesei）的丝氨酸蛋白酶。在表达 SLP2(12–469_His) 的 T. reesei 系统中，使用 IMAC 纯化上清液测定蛋白酶活性，分别在添加或不添加 TrI9、PMSF 或青霉素类抑菌素（chymostatin）的情况下进行；同样纯化的母系菌株样品作为对照。图 inset 显示了部分纯化 SLP2 样品的蛋白酶活性与 TrI9 浓度的关系，其中曲线为四参数逻辑回归拟合。主图中显示的 TrI9 结果对应 inset 中所示最高浓度。活性以胰蛋白酶为基准进行归一化，并相对于 SLP2 样品的活性表示。b 在等体积的 P. pastoris 上清液中，分别检测了表达 T. reesei SLP1、SLP3、SLP6 或 SLP8 的蛋白酶活性，分别在添加或不添加 100 nM 合成 TrI9 的情况下进行。对照组包括母系菌株（SMD）和表达 PEP4 的菌株。PMSF 用作对照丝氨酸蛋白酶抑制剂。活性均以 SLP3 为参考值。条形图/点状图表示平均值；误差线表示两（a）或三（b）次试验的标准差。与无抑制剂条件相比的统计显著性采用 Games-Howell 随机化后检验评估。