三种聚咪唑离子液体对沙门氏菌的抑菌活性筛选与安全性评价
摘要：研究旨在探究一类高效安全的抑菌材料对沙门氏菌的抑菌活性及其在家禽沙门菌防控中的应用潜力。试验通过化学合成3种聚咪唑（Polyimidazolium，PIM）PIM0、PIM1、PIM2，测定其对肠炎沙门氏菌和肯塔基沙门氏菌的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）、生长曲线、存活率的影响评价其抑菌性能；通过测定其对HeLa和HD11细胞的体外细胞毒性、BALB/c小鼠体重等生理变化和存活情况的影响评价其安全性；通过测定其对模拟家禽生产中地面和设备的瓷砖和不锈钢板表面沙门氏菌的抑菌效果评价其在家禽沙门氏菌防控中的应用潜能。结果显示：3种聚咪唑对不同血清型沙门氏菌均有一定的抑菌效果，其中PIM2的MIC值为2 μg/mL，低浓度（10 μg/mL）时即可抑制细菌生长，高浓度（100 μg/mL）时完全抑制细菌生长，显示其对沙门氏菌的抑菌效果最好；HeLa细胞和HD11细胞在不同浓度的3种聚咪唑中均有较高的存活率，其中在PIM0中存活率最高，达80%以上；3种聚咪唑灌胃后的小鼠在21 d的试验周期内存活率为100%，高浓度PIM2（1000 μg/mL）处理后肝细胞变性及盲肠损伤，但整体损伤程度较低；PIM2杀菌效果最好，低浓度（10 μg/mL）抑菌率（Inhibition rate，IR）达99.8%以上。研究表明，3种聚咪唑均有较好的沙门氏菌抑菌效果且安全性较高，表现出在家禽养殖和屠宰过程中沙门氏菌控制中的应用潜能，为进一步开展家禽生产过程中沙门氏菌的现场防控奠定基础。
沙门氏菌是一种典型的食源性人兽共患病原菌，也是家禽在内的畜禽等养殖、屠宰加工等各个环节流行的主要致病细菌。沙门氏菌通过肉和蛋等畜禽产品传播给人类并导致肠胃炎或全身性沙门氏菌感染，严重危害人类生命健康。控制畜禽产业链中的沙门氏菌对保证食品安全和人类健康尤为重要。目前，畜禽养殖业及其加工业主要使用漂白粉、过氧乙酸、氯制剂等传统化学消毒剂控制沙门氏菌。尽管这些传统化学消毒剂具有较好的杀菌效果，但长期使用可能引发诸如病原耐受导致的消毒效果下降等问题，甚至与抗生素耐药性相互交联，增加“超级细菌”风险。大量消毒剂的使用和排放也会增加对从业人员甚至消费者的安全隐患，造成污染环境等。因此，研究开发高效安全的新型抑菌材料并用于控制畜禽生产过程中的沙门氏菌具有重要的意义。
近年来，聚咪唑盐（Polyimidazolium，PIM）离子液体因其独特分子结构而展现出高效安全的抑菌性能，研究设计和合成新型PIM成为病原菌控制领域新的研究方向。PIM是一种无色、无刺激气味、热稳定性和化学稳定性好、易降解、代谢周期短的新型聚合物离子液体，由聚咪唑阳离子和其他阴离子组成。PIM的阳离子可与细胞膜结合并破坏磷脂双层结构，影响细胞扩散及代谢过程，从而对革兰氏阴性和阳性菌包括多重耐药菌以及真菌等均具有显著的抑菌效果，表现出高效广谱抗菌性能。针对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等常见的不同病原菌，还可通过分子设计改变PIM阳离子和阴离子的类型和比例从而提高其针对性的杀菌性能。此外，PIM离子液体具有的低挥发性可降低环境的二次污染，且其水溶性好和溶液稳定性高，适合长期储存与应用。因此，PIM离子液体有望成为替代传统化学消毒剂的重要候选。本研究化学合成3种聚咪唑，并分析其对沙门氏菌的抑菌性能、体外细胞毒性、小鼠体内安全性、实验室模拟污染抑菌效果等，评估其作为家禽沙门氏菌新型抑菌材料的潜能，为下一步在家禽生产过程中沙门氏菌防控中的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株、细胞和试验动物
肠炎沙门氏菌C50041（登录号CMCC50041）、人HeLa细胞、鸡巨噬细胞系HD11由江苏省人兽共患病学重点实验室保存；肠炎沙门氏菌TX14、肯塔基沙门氏菌HJ8、肯塔基沙门氏菌TK4由江苏省人兽共患病学重点实验室分离、保存。6~8周龄SFP级BALB/c雌鼠购自扬州大学比较医学研究院。所有小鼠均饲养在具有独立进风系统的专用笼中，所有动物实验均符合扬州大学实验动物伦理委员会规定（伦理审查编号：202405012）。
1.2 主要试剂及仪器
主要试剂：Mueller Hinton（MH）液体培养基、Luria-Bertani（LB）液体培养基购自英国BD公司；高糖型DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶购自美国GIBCO公司；Xylose Lysine Tergitol 4（XLT4）基础培养基、XLT4 Agar supplement、磷酸缓冲盐溶液（Phosphate buffer saline，PBS）购自 Becton Dickinson公司；酵母粉（YeastExtract）、蛋白胨（Tryptone）购自Oxoid公司；Agar购自Biosharp公司；1,3-二氨基丙烷、1,4-二氨基丁烷、1,8-二氨基辛烷、甲醛（含水量为37%）、乙二醛（含水量为40%）、NaClO购自上海阿拉丁生化科技有限公司；盐酸（含水量37%）购自北京化工厂。
主要仪器：Spectra/Por6透析膜（1 ku分子量截留）购自瑞普利金（上海）生物科技有限公司。BioPhotometer D30型分光光度计、SY2230型水浴锅、spark型酶标仪、RE-52AA型旋转蒸发仪、A21285型生物安全柜购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Fresco21型小型台式离心机、SPX300BSH-II型恒温培养箱、3111型细胞培养箱购自德国Eppendorf公司；oCelloScope微生物生长动态监测系统、µCount3D微生物计数仪购自丹麦Biosense公司；Avance DPX-300型核磁共振仪购自美国Bruker公司。
1.3 PIM的化学合成和鉴定
将蒸馏水（0.5 mol）、盐酸（68.4 mmol）和二胺（34.2 mmol，1,3-二氨基丙烷、1,4-二氨基丁烷、1,8-二氨基辛烷）的混合溶液在冰水浴中保持30 min，然后将甲醛（2.56 mL，34.2 mmol）和乙二醛（3.93 mL，34.2 mmol）的混合溶液逐滴加入其中，反应混合物在80 ℃下搅拌反应约5 h，当混合溶液从无色逐渐变为黄色时结束反应；用旋转蒸发仪去除混合溶液中的大部分溶剂和未反应物，得到一种黄色的黏稠油状物；用水稀释后，在透析膜中用酸水（pH值为3~4）透析1 d，得到的溶液经过冻干处理，即为纯化后的PIM（PIM0、PIM1、PIM2），合成路线见图1。使用核磁共振仪，采用《中华人民共和国药典》（2020年版四部）所述方法对合成的PIM分子结构进行鉴定。
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