小龙虾贮藏过程中优势腐败菌筛选、及微生物菌群结构分析（一）
摘要：以4℃贮藏小龙虾货架期终点筛选武汉孝感小龙虾中优势腐败菌，同时结合高通量测序方法，进一步确定小龙虾中优势腐败菌，并对小龙虾贮藏过程中菌相变化、微生物结构及其多样性进行分析。结果表明：传统培养法从腐败小龙虾中共筛选出10株腐败菌，包括波罗的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）等；在属水平上，高通量测序法最终确定气单胞菌属（Aeromonas sp.）及希瓦氏菌属（Shewanella sp.）是小龙虾腐败末期相对丰度最大的2种优势腐败菌；同时，高通量测序结果表明，随着贮藏时间的延长，小龙虾微生物群落丰富度、多样性及均匀度不断下降，这与腐败末期优势腐败菌的大量增长及生长繁殖过程中抑制其他种类微生物有关。
小龙虾，也称克氏原螯虾（Procambarus clarkii），属于淡水经济虾类，原产于北美洲地区，19世纪30年代引入我国。因其风味独特、肉质鲜美，同时具有高蛋白、低热量的特性，受到广大消费者的喜爱，成为人们餐桌上常见的美食。水产品由于营养丰富且水分含量较高而容易引起细菌的增殖进而腐败，难以保存。而小龙虾好温喜湿，常见于淤泥等复杂生长环境，因此其本身携带的微生物种类和数量更多。同时，小龙虾含有大量的自由氨基酸及内源氧化酶，因此相较于其他水产品而言，更容易遭到微生物的侵袭，这些都在一定程度上影响了小龙虾产业的发展。
大量研究发现，在水产品腐败过程中部分种类细菌的数量逐渐上升并占据绝对优势地位，对水产品的腐败变质起着主导作用，这些细菌被称为优势腐败菌，其为水产品品质下降最重要的原因。不同水产品的优势腐败菌种类会存在一些差异，于淑池等发现，冷藏卵形鲳鲹中优势腐败菌为希瓦氏菌及假单胞菌，Leroi等在4℃冷藏生鲑鱼中发现其优势腐败菌主要为假单胞菌，南美白对虾中主要腐败菌则为不动杆菌、希瓦氏菌，而淡水水产品，如鲢鱼和草鱼中的优势腐败菌主要为气单胞菌和假单胞菌。对于水产品中优势腐败菌的筛选和鉴定，在早期的研究中一般都是利用传统培养法进行。随着分子生物学的进步与发展，目前研究中广泛利用传统培养法结合高通量测序法对优势腐败菌进行筛选和鉴定。同时，高通量测序方法还可以对贮藏过程中水产品的微生物结构组成及其多样性进行分析，目前已在带鱼、牡蛎等水产品中成功应用，明确了微生物在产品贮藏过程中的变化趋势。
本研究筛选和鉴定武汉孝感小龙虾4℃贮藏过程中的优势腐败菌，并对小龙虾贮藏过程中菌相变化以及微生物菌群结构及其多样性进行分析。优势腐败菌是水产品品质的关键控制点，与水产品货架期密切相关，因此开展对小龙虾中优势腐败菌的研究与筛选鉴定，有利于下一步利用杀菌保鲜技术靶向杀灭优势腐败菌，提高保鲜效果，延长小龙虾货架期。
1材料与方法
1.1材料与试剂
小龙虾来源于武汉孝感，经加冰保活运送至实验室备用，进行实验操作前加冰猝死。
氯化钠、硼酸、氧化镁、盐酸国药集团化学试剂有限公司；营养琼脂（nutrient agar，NA）、假单胞菌选择性琼脂（Pseudomonas CFC selective agar，CFC）培养基、三糖铁琼脂（triple sugar iron agar，TSI）培养基、BP（Baird-Parker）培养基、气单胞菌基础（Aeromonas medium base，RYAN）培养基青岛海博生物技术有限公司。
1.2仪器与设备
凯氏定氮仪；电子天平；TS-2402CL恒温振荡器；恒温培养箱；GI80TW全自动高压灭菌器。
1.3方法
1.3.1小龙虾贮藏期间菌落总数的测定
采用活菌平板计数法，测定小龙虾中总需氧菌菌落总数，测定方法参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》。称取10 g虾肉，加入90 mL无菌生理盐水，在无菌条件下匀浆，制成10 g/100 mL样品均质液。之后用生理盐水进行10倍梯度稀释。取稀释后的样品100μL涂布于NA平板上，于30℃恒温培养箱中培养36～48 h，选取合适的平板进行菌落计数，单位为lg（CFU/g）。
1.3.2小龙虾贮藏期间总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的测定
每隔2 d测定小龙虾中TVB-N含量，测定方法参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中的方法二自动凯氏定氮仪法。准确称取2 g虾肉糜于蒸馏管中，之后加入75 mL纯水，振荡使样品均匀分散，并在水中浸渍30 min。测定前加入1 g MgO，将蒸馏管连接至自动凯氏定氮仪。以20 g/L硼酸为接收液，0.01 mol/L盐酸为滴定液，1 g/L甲基红-乙醇溶液和1 g/L溴甲酚绿-乙醇溶液以体积比1:5混合作为混合指示剂。
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