四菌株、五浓度、一致性R²≥0.95：MicroQuant™在自动化快速微生物检测中的性能全解析
快速微生物检测方法（RMMs）的成功实施，有赖于能够制备出可重复、特性明确的微生物接种物，以用于方法验证。在本研究中，MicroQuant™ 定量参考菌株为 RMM 工作流程的验证提供了标准化且可靠的接种物来源。当与 μCount3D™ 自动化微生物细胞计数系统及 IntuGrow 快速生长型检测平台联用时，MicroQuant™ 能够实现与对照方法的高度一致性，采用盘式计数法，线性度（R² ≥0.95）、回收率和精密度均符合现行药典标准限值。 除分析性能外，MicroQuant™ 通过省去培养扩增步骤，并减少生长阶段、人工计数及操作者依赖性带来的变异性，简化了接种物制备流程。与传统接种物制备方式相比，使用 MicroQuant™ 不仅提高了工作流程效率，同时保持了可靠的定量性能，有助于更快生成可验证的数据。
图1、使用MicroQuant™进行RMM验证的工作流程——IntuGrow与传统平板计数法的并行比较。该工作流程展示了用于生成和评估微生物接种量的标准方法，以确保方法可比性和验证的可靠性。(1) 从2–8°C储存条件下取出MicroQuant™小瓶，随后(2) 使用配套缓冲液快速重水合MicroQuant™沉淀物。(3) 利用μCount3D™平台（一种自动微生物细胞计数系统）确认初始浓度，以确保接种量输入准确。(4) 制备一系列稀释液以达到目标接种量水平。(5) 使用IntuGrow基于快速生长的检测平台对样品进行分析，同时(6) 采用传统平板计数法进行平行计数。(7) 按照USP <1223>标准，将两种方法的结果进行比较，以评估其定量一致性及方法等效性。 MicroQuant™工作流程采用预量化、标准化的格式，操作简便，最大限度地减少了传统过夜培养流程中导致变异的多种因素。
图2、接种物制备流程对比——MicroQuant™ 与传统培养法在RMM检测中的应用。该示意图对比了两种在分析前制备微生物接种物的方法。在MicroQuant™流程中，（1A）从2–8°C储存的MicroQuant™试剂瓶中取出即用型产品，然后（1B）快速复水（约1分钟），生成可定量的起始悬浮液。而在传统流程中，（2A）从冷冻库存或培养皿中回收微生物，随后（2B）进行分批传代和培养，以达到足够生长，通常需要18–24小时，甚至数天，具体取决于微生物种类。（2C）培养物随后被制备用于分析，其步骤与MicroQuant™流程一致。（3）制备好的悬浮液被导入μCount3D™平台，之后（4）根据需要制备一系列稀释液。（5）样品使用IntuGrow检测系统进行分析，（6）结果进行处理并报告。该对比凸显了MicroQuant™显著缩短了制备时间，并提升了标准化水平，最大限度地减少了最小化传统工作流程中与生长阶段和操作者依赖性相关的变异性。
图3、IntuGrow衍生结果与使用MicroQuant™参考微生物测定的药典板计数结果之间的线性关系。对以下样品进行了线性性评估：(A) 布拉西利斯曲霉（ATCC® 16404-HQ-PACK™，目标浓度为12.5、25、50和100 CFU/mL），(B) 白色念珠菌（ATCC® 10231-HQ-PACK™，目标浓度为25、50、100和200 CFU/mL），(C) 拟杆菌属（ATCC® 9027-HQ-PACK™，目标浓度为25、50、100和200 CFU/mL），以及(D) 金黄色葡萄球菌亚种（ATCC® 6538-HQ-PACK™，目标浓度为25、50、100和200 CFU/mL）。数据以Log10尺度绘制用于回归分析。每个数据点代表三次独立重复测量的平均值。虚线表示身份线。接受标准定义为R² ≥ 0.95。
图4、对IntuGrow系统和复合板计数法在MicroQuant™参考微生物上的精确评估。 变异系数（CV%）在五个目标稀释水平下计算，每种稀释水平设有三个独立重复样本（N = 3个重复 × 5个稀释水平 = 每种微生物15个样本）。条形图高度表示各稀释水平下的平均CV%，误差线表示特定稀释水平下CV%值的标准差。虚线方括号表示通过单因素方差分析后进行Tukey事后比较的方法间统计差异（ns = 无显著差异）。
图5、使用MicroQuant™参考材料生成的IntuGrow生长曲线。对（A）巴西曲霉（ATCC® 16404-HQ-PACK™）、（B）白色念珠菌（ATCC® 10231-HQ-PACK™）、（C）铜绿假单胞菌（ATCC® 9027-HQ-PACK™）和（D）金黄色葡萄球菌亚种金黄色葡萄球菌（ATCC® 6538-HQ-PACK™）进行了生长动力学评估。每条曲线代表在指定靶标接种浓度（CFU/mL）下获得的平均IntuGrow衍生计数。每条曲线周围的阴影带表示重复测量的标准差。虚线垂直线表示检测时间（TTD），阴影蓝色区域表示结果获取时间（TTR）窗口。
总结
MicroQuant™ 可作为标准化 RMM 验证流程的基础工具。 通过提供即用型的预定量微生物参考材料，MicroQuant™ 有助于减少方法验证中的关键变异来源，使实验室能够更自信、更可靠且更高效地采用替代的微生物检测方法。随着制药行业持续采用数据驱动的微生物检测策略，标准化参考材料将发挥重要作用。诸如MicroQuant™之类的材料可在加快验证的同时，确保符合USP <1223>和EP-5.1.6的要求。
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