研究背景：本研究针对出芽短梗霉（即普鲁兰金黄酵母）在静态液体培养中不同细胞类型的形成与分化动态开展定量解析，并建立了描述该过程的时间依赖数学模型。该菌是一种二态性黑色酵母，可形成芽生孢子、膨大细胞、菌丝以及厚垣孢子等多种细胞类型，已被用作作物与木材的生物保护剂，并能促进植物养分吸收、增强其抗旱、耐热与耐盐能力，但各类细胞在其功能发挥中的角色及形成规律此前尚不明确。

研究选取 CBS 584.75、CBS 100280、CBS 109810 和 CBS 140240 四个菌株，于 26 °C、pH 5 的马铃薯葡萄糖液体培养基中静置培养，借助 oCelloScope 成像仪进行接种后 1 小时起、长达 22 小时的逐时延时显微观测；通过细胞面积、圆度、细化长度与对比度等参数自动判别芽生孢子、膨大细胞、厚垣孢子和菌丝，并结合基于最近邻算法的坐标追踪与人工校正重建细胞谱系，对 250 个细胞的分裂事件逐一判读，从而实现对分裂与分化过程的定量刻画。结果显示16 小时内芽生孢子可由膨大细胞、菌丝及已有芽生孢子分裂产生，同时芽生孢子又可分化为膨大细胞、膨大细胞进一步分化为菌丝。尽管接种时芽生孢子占比超过 75%，培养 10 小时后其已不再是最优势细胞类型。

在此基础上，研究以新类型菌株 CBS 584.75 的 1–16 小时数据为输入、以培养时间为变量，构建了一组常微分方程模型，采用 Erlang 链（每种细胞类型设 4 个亚阶段）刻画分裂与分化之间更真实的渐进等待时间，参数涵盖各成熟细胞产生芽生孢子的速率、平均等待时间及被约束于低水平的死亡速率，并以 SciPy 的刚性求解器与差分进化算法完成数值求解与参数拟合（损失函数为各时间点观测与预测细胞计数的平方误差和）。模型预测自 18 小时起芽生孢子重新占据优势，至 72 小时芽生孢子、膨大细胞与菌丝的相对丰度分别为 57%、32% 和 11%。该定量评估方法与数学模型为后续优化 A. pullulans 作为生物保护剂和植物生长促进剂的应用性能提供了可推广的分析框架。。

丹麦Biosense微生物生长动态监测系统的应用

研究人员在 24 孔悬浮培养板的每孔中加入 400 μl pH 5 的马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）并接种 10³ 个细胞，于 26 °C 静置培养，在接种后 1 小时待细胞沉降至孔底后启动扫描，设定扫描区域长度为 855 μm、对象面积阈值 70–6000 像素、最大对象数 1000，此后每小时扫描一次、最长持续 22 小时。

ocelloScope微生物动态监测系统是基于对象面积、圆度、细化长度与对比度四类参数，在时间序列中自动识别并区分芽生孢子、膨大细胞、厚垣孢子与菌丝（假菌丝归入菌丝组）——芽生孢子与膨大细胞依面积（≤275 与 >275）划分，厚垣孢子以高对比度（>0.4）区别于膨大细胞，菌丝则以低圆度（≤0.85）和长细化长度（>30）判别，并允许研究人员手动剔除代表非细胞的颗粒杂质，从而把原本依赖经验判断的二态性形态差异转写为可复现的量化判别标准。

oCelloScope 微生物动态监测系统配合 UniExplorer 软件（版本 8.1.0.7682-RL2）构成了整个延时显微观测的核心平台，用于对静态液体培养中的普鲁兰金黄酵母进行非侵入、逐时的动态监测。oCelloScope 设备生成的、具时间分辨力的细胞丰度与分裂/分化事件数据，既直接支撑了"接种时占比超 75% 的芽生孢子在培养 10 小时后不再是最优势类型"这一关键表型发现，又作为唯一输入（新类型菌株 CBS 584.75 在 1–16 小时内的芽生孢子、膨大细胞与菌丝丰度）驱动了基于常微分方程与 Erlang 链的细胞动态数学模型的拟合，使模型得以预测 18 小时后芽生孢子重新占据优势、至 72 小时三类细胞相对丰度分别为 57%、32% 与 11%。整套实验设置了生物学三重复（不同接种物与培养基储备）与每重复三技术重复（同一接种物与培养基的三个孔），而 oCelloScope 的自动化、高通量成像能力正是支撑这一重复规模与逐时采样密度得以实现的前提。

实验结论

本研究在固定静态液体培养条件（26 ℃、PDB pH 5、静置）下，对出芽短梗霉四个来源与生境差异显著的菌株（CBS 584.75、CBS 100280、CBS 109810、CBS 140240）进行了逐时定量延时观测，并以新类型菌株 CBS 584.75 为代表建立数学模型，得出以下核心结论：芽生孢子、膨大细胞与菌丝三类细胞并非彼此孤立，而是构成一个持续相互转换的动态体系——在 16 小时培养期内，芽生孢子既可由已有芽生孢子分裂产生，也可由膨大细胞和菌丝分裂产生，即三类成熟细胞均具备产孢能力。与此同时，芽生孢子可分化为膨大细胞，膨大细胞又进一步分化为菌丝，从而形成"芽生孢子↔膨大细胞→菌丝"这一兼具可逆出芽与定向分化特征的路径，而厚垣孢子因在培养物中占比极低未纳入定量与建模框架。

由于这种持续的分化流向，尽管接种时芽生孢子占比超过 75%，培养至 10 小时后其已不再是培养物中的最优势细胞类型，说明优势类群随孵育时间发生显著更替而非静态维持。在此基础上，以 CBS 584.75 在 1–16 小时的实测细胞丰度为输入、以培养时间为唯一变量所构建的常微分方程模型（采用含 4 个亚阶段的 Erlang 链刻画分裂与分化间的渐进等待时间，各成熟细胞设产孢速率、平均等待时间及被约束于低水平的死亡速率，并以平方误差和最小化为目标进行参数拟合）成功重现了观测动态，并进一步外推预测。

自 18 小时起芽生孢子将重新成为最优势类群，至 72 小时芽生孢子、膨大细胞与菌丝的相对丰度分别稳定在 57%、32% 与 11%，提示该体系在经历中期菌丝与膨大细胞扩张后，最终会回归以芽生孢子为主导的稳态结构。本研究首次以定量方式刻画了 A. pullulans 细胞类型的形成、分裂与分化动力学，并提供了可预测任意时间点细胞组成比例的数学模型，这为后续解析各类细胞在生物保护与植物促生中的具体功能分工、优化商业化制剂的细胞类型配比及施用时机，提供了方法学基础与理论依据。

图1、基于16小时静态液体PDB培养实验数据（B）拟合数学模型所得的A.普鲁兰菌株CBS 584.75（长时）种群动态及细胞分化情况概述。为此，采用了生物重复三次、每组三份技术重复的汇总数据。图B上部面板显示了三种细胞类型随时间变化的相对丰度，下部面板则在对数变换的纵轴上显示绝对数量。红色虚线表示菌丝体产生的子囊孢子数量超过其他细胞类型的时刻。

图2、静态液态PDB培养中，A.普鲁兰菌株CBS 584.75（A）、CBS 100280（B）、CBS 109810（C）和CBS 140240（D）的延时显微镜图像，显示了分生孢子（实心箭头）、肿胀细胞（空心箭头）、衣原体孢子（空箭头）以及菌丝（实心箭头）。比例尺为100 μm。

图3、在静态液体PDB中孵育16小时期间，A.普鲁兰菌株CBS 584.75（A）、CBS 100280（B）、CBS 109810（C）和CBS 140240（D）的细胞动力学。T = 0为开始孵育后1小时的时间点，此时细胞已沉降至孔底。误差棒表示三次生物重复和三次技术重复的标准差（SD）。

图4、在静态液体PDB培养基中，A. pullulans CBS 584.75的分化（A）和细胞分裂（B）过程。（A）包括芽孢子母细胞在肿胀细胞中的分化，以及肿胀细胞转化为衣原体孢子和菌丝；而（B）则包括芽孢子母细胞、肿胀细胞和菌丝的细胞分裂，形成新的芽孢子母细胞。图（B）中各百分比表示产生新芽孢子母细胞的细胞类型。圆圈内的数字表示每个正在分裂的细胞所形成的芽孢子母细胞数量。例如，数字2表示平均每个活跃分裂的芽孢子母细胞可形成2个新芽孢子母细胞。图（A）中的百分比基于三次生物重复实验的全部汇总数据，每次实验包含三个技术重复；而图（B）中则分析了来自三次生物重复的总共250个独立细胞（即芽孢子母细胞+肿胀细胞+菌丝），且每组至少包含一个技术重复。

总结

出芽短梗霉被用作作物与木材的生物保护剂，并可促进植物生长。该真菌可形成包括芽生孢子、膨大细胞和菌丝在内的多种细胞类型，但这些细胞在出芽短梗霉生物保护功效中各自扮演何种角色，目前尚未被阐明。

本研究对四个分离株在静态液体培养中芽生孢子、膨大细胞与菌丝的形成及分化动态进行了定量评估：在 16 小时的培养过程中，芽生孢子可由膨大细胞、菌丝以及既有的芽生孢子经细胞分裂产生，与此同时芽生孢子又可分化为膨大细胞，而膨大细胞进一步分化为菌丝；因此，尽管接种时芽生孢子占比超过 75%，培养 10 小时后其已不再是培养物中最优势的细胞类型。

在此基础上研究基于常微分方程建立了数学模型，用以描述新类型菌株出芽短梗霉 CBS 584.75 在固定培养条件下随时间的细胞动态变化，模型以其 16 小时静态液体培养的定量数据为输入、并以培养时间作为输入变量。模型预测自培养 18 小时起芽生孢子将再次成为最优势的细胞类型，至培养 72 小时后，芽生孢子、膨大细胞与菌丝的相对丰度分别为 57%、32% 和 11%。该细胞分裂与分化的定量评估方法及其数学模型可用于后续研究，以优化出芽短梗霉作为生物保护剂的性能并提升其促进植物生长的效果。在本研究中，oCelloScope 微生物动态监测系统配合 UniExplorer 软件（版本 8.1.0.7682-RL2）构成了整个延时显微观测的核心平台，用于对静态液体培养中的普鲁兰金黄酵母进行非侵入、逐时的动态监测。oCelloScope 的自动化、高通量成像能力正是支撑这一重复规模与逐时采样密度得以实现的前提，没有该设备将真菌生长过程转化为可计数的连续动态数据流，本研究的定量评估与数学建模均无从建立。

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