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野生黑木耳N56菌株分离纯化、菌丝生长速率实验(一)

来源:食品研究与开发 发布时间:2024-07-15 22:47:41 浏览:11 次

从黑龙江东部山区的柞栎木上分离纯化采集到61株黑木耳野生菌株,按照常规育种程序,对这些菌株的性状进行研究比较,结果表明:N56号菌株的纤维素酶活力为4633 U/g,生物学效率为93.7,产量为(42±5)g/袋,菌丝生长速率为5.4 mm/d,其各方面性状皆优于对照菌株(当地普遍推广使用的)黑微29,可作为产业化开发的母种进行推广。


木耳营养丰富,含蛋白质、脂肪、钙、碳水化合物、磷、铁、胡萝卜素、维生素,此外含有大量纤维、钾、镁和钠等。美国科学家发现黑木耳能减低血液凝块、肝和冠状动脉硬化,并且能明显地防止血栓的形成。保持黑木耳稳产、维持产品质量的首位关键因素是生产菌株的真确性,不同菌株的生物学效率相差很大,产品的形态特征甚至口感不尽相同。大量菌株的品种退化、老化和不利变异,造成栽培特性和产量的不确定性[1],一些退化的菌株严重损害了生产者的利益,获得一株优质高产的新菌株势在必行。


1材料与方法


1.1材料


1.1.1培养基


1.1.1.1母种培养基


马铃薯葡萄糖(PDA)和综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基(CPDA),参照文献[2]配制。


1.1.1.2原种和栽培培养基(w/w)


阔叶树木屑78%,麦麸20%,蔗糖1%,石膏1%,含水量(58±2)%。菌袋尺寸17 cm×33 cm,每袋装干料350 g左右。


1.1.2菌株


供试菌株系从黑龙江省东部山区呼玛、伊春、东宁、勃利、柴河、尚志、鸡东等32个地点的柞栎木上野生黑木耳或耳木上分离,纯化后保存在锯木屑中,共61株菌株;对照菌株黑微29(当地畅销的主要栽培菌种)。


1.2方法


1.2.1菌种分离方法


将自野外收集到的标本,核对原始序号,标本表面用0.1%升汞消毒,无菌水清洗3次~5次,按无菌操作程序进行组织分离。为便于纯化接种在直径Ф90 mmPDA培养皿上,纯化后移入试管,同时接入盛有木屑的试管内,作为备份[3]。


1.2.2选育程序


选育工作按常规育种程序进行,即从收集到的野生菌种资源开始,经组织分离、菌种培养、生理性能测定、初筛、复筛、区别性鉴别等,综合评价确定入选菌株。


1.2.2.1初筛[4]


将分离到的61株野生黑木耳菌种和对照菌株黑微29分别接种在PDA培养皿上,28℃,一起培养,隔日观察生长情况。同时分2批进行拮抗试验。


将保留下来的18株菌株作为原种进行扩大培养。同时配制栽培培基质,严格控制含水量和pH,使用15 mm×28 mm耐126℃高温符合GB 9687-1988《食品包装用聚乙烯成型卫生标准》[4]规定的聚丙烯塑料袋分装,高压灭菌(126℃,1.5 h~2 h),冷却,次日接种,每个菌株接种10袋,重复3次。接种后按常规管理,定时观察、记录菌丝萌发、蔓延、原基形成、出耳及环境温度、湿度状况;计算供试菌株的鲜重g/袋、干重g/袋和生物学效率。


1.2.2.2复筛


将初筛中入选的6株菌株进行活化和扩大培养,制成原种,按初筛的方法进行复筛。每组接种30袋,重复3次,在同一条件下栽培,同时做生化测定以确定N56号菌株的真确性。


1.2.2.3栽培试验


配制袋栽基质,袋栽的基质为阔叶树杂木锯屑。其中锯屑占78%、糠麸20%、石膏1%和石灰1%,基质含水量60%。菌袋尺寸为17 cm×33 cm,每个菌株接种30袋,样本数量≥30,符合统计学的大样本要求,重复3次。接种后按常规管理,定时观察和记录。产品性状、质量按NY/T749-2003《绿色食品食用菌》[5]进行评价。


1.2.3培养特征观察


菌丝形态观察系将斜面供试菌种中注入适量无菌水,刮下菌苔并摇匀,吸收0.1 mL菌液于装有PDA培养基的Φ90 cm培养皿上涂布均匀,置于24℃~25℃恒温箱中,隔日观察并测量菌丝蔓延速度,记录生长情况。用Champ Gel全自动凝胶图像处理系统样本并计算出菌丝密度[1]。


1.2.4生长特性研究


将N56号菌株和黑微29黑微29分别接种在PDA培养基和栽培培养基上,作3次重复。设置10个培养温度(6、10、14、18、22、26、30、34、38、40℃),6个初始pH(pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0),比较菌丝生长速率。


1.2.5拮抗实验


将测定菌接种于PDA液体培养基中,28℃、200r/min振荡培养3 d~5 d。菌悬液离心(12000r/min),取上清,4℃保存备用,用琼脂扩散法[6],拮抗反应的形态特征隆起型、沟型、隔离型按GB/T12728《食用菌术语》[7]规定的定义判定。


1.2.6纤维素酶活力测定


对培养袋定期取样,每次取样样本重量相同,均为20.0 g,加40 mL生理盐水,迅速封口,在(40±1)℃水浴中提取酶液,过滤,吸取酶液3 mL,用3,5-二硝基水杨法[8]测定菌丝生长阶段和出茹阶段的纤维素酶活力。


1.2.7多糖的测定


从栽培场地中取代表性的子实体,去杂后精确称取4.00 g,加少量热水浸泡2 h。反复用滤纸吸干多余水分,加50 mL蒸馏水,进行高压浸提(0.1 MPa,121℃)30 min。滤过取清液,用Seveg法去杂质,5倍冰冻乙醇沉淀多糖。用蒽酮比色法在550 nm波长下测定OD值由标准曲线查算还原糖含量[9]。


野生黑木耳N56菌株分离纯化、菌丝生长速率实验(一)

野生黑木耳N56菌株分离纯化、菌丝生长速率实验(二)

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