野生黑木耳N56菌株分离纯化、菌丝生长速率实验（一）
从黑龙江东部山区的柞栎木上分离纯化采集到61株黑木耳野生菌株，按照常规育种程序，对这些菌株的性状进行研究比较，结果表明：N56号菌株的纤维素酶活力为4633 U/g，生物学效率为93.7，产量为（42±5）g/袋,菌丝生长速率为5.4 mm/d,其各方面性状皆优于对照菌株（当地普遍推广使用的）黑微29,可作为产业化开发的母种进行推广。
木耳营养丰富，含蛋白质、脂肪、钙、碳水化合物、磷、铁、胡萝卜素、维生素，此外含有大量纤维、钾、镁和钠等。美国科学家发现黑木耳能减低血液凝块、肝和冠状动脉硬化，并且能明显地防止血栓的形成。保持黑木耳稳产、维持产品质量的首位关键因素是生产菌株的真确性，不同菌株的生物学效率相差很大，产品的形态特征甚至口感不尽相同。大量菌株的品种退化、老化和不利变异，造成栽培特性和产量的不确定性[1]，一些退化的菌株严重损害了生产者的利益，获得一株优质高产的新菌株势在必行。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1培养基
1.1.1.1母种培养基
马铃薯葡萄糖（PDA）和综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CPDA），参照文献[2]配制。
1.1.1.2原种和栽培培养基（w/w）
阔叶树木屑78%，麦麸20%，蔗糖1%，石膏1%，含水量（58±2）%。菌袋尺寸17 cm×33 cm，每袋装干料350 g左右。
1.1.2菌株
供试菌株系从黑龙江省东部山区呼玛、伊春、东宁、勃利、柴河、尚志、鸡东等32个地点的柞栎木上野生黑木耳或耳木上分离，纯化后保存在锯木屑中，共61株菌株；对照菌株黑微29（当地畅销的主要栽培菌种）。
1.2方法
1.2.1菌种分离方法
将自野外收集到的标本,核对原始序号,标本表面用0.1%升汞消毒,无菌水清洗3次～5次,按无菌操作程序进行组织分离。为便于纯化接种在直径Ф90 mmPDA培养皿上，纯化后移入试管，同时接入盛有木屑的试管内，作为备份[3]。
1.2.2选育程序
选育工作按常规育种程序进行，即从收集到的野生菌种资源开始，经组织分离、菌种培养、生理性能测定、初筛、复筛、区别性鉴别等，综合评价确定入选菌株。
1.2.2.1初筛[4]
将分离到的61株野生黑木耳菌种和对照菌株黑微29分别接种在PDA培养皿上，28℃，一起培养，隔日观察生长情况。同时分2批进行拮抗试验。
将保留下来的18株菌株作为原种进行扩大培养。同时配制栽培培基质，严格控制含水量和pH，使用15 mm×28 mm耐126℃高温符合GB 9687-1988《食品包装用聚乙烯成型卫生标准》[4]规定的聚丙烯塑料袋分装，高压灭菌（126℃，1.5 h～2 h），冷却，次日接种，每个菌株接种10袋，重复3次。接种后按常规管理，定时观察、记录菌丝萌发、蔓延、原基形成、出耳及环境温度、湿度状况；计算供试菌株的鲜重g/袋、干重g/袋和生物学效率。
1.2.2.2复筛
将初筛中入选的6株菌株进行活化和扩大培养，制成原种，按初筛的方法进行复筛。每组接种30袋，重复3次，在同一条件下栽培，同时做生化测定以确定N56号菌株的真确性。
1.2.2.3栽培试验
配制袋栽基质,袋栽的基质为阔叶树杂木锯屑。其中锯屑占78%、糠麸20%、石膏1%和石灰1%，基质含水量60%。菌袋尺寸为17 cm×33 cm，每个菌株接种30袋，样本数量≥30，符合统计学的大样本要求，重复3次。接种后按常规管理，定时观察和记录。产品性状、质量按NY/T749-2003《绿色食品食用菌》[5]进行评价。
1.2.3培养特征观察
菌丝形态观察系将斜面供试菌种中注入适量无菌水，刮下菌苔并摇匀，吸收0.1 mL菌液于装有PDA培养基的Φ90 cm培养皿上涂布均匀，置于24℃～25℃恒温箱中，隔日观察并测量菌丝蔓延速度，记录生长情况。用Champ Gel全自动凝胶图像处理系统样本并计算出菌丝密度[1]。
1.2.4生长特性研究
将N56号菌株和黑微29黑微29分别接种在PDA培养基和栽培培养基上,作3次重复。设置10个培养温度（6、10、14、18、22、26、30、34、38、40℃），6个初始pH（pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），比较菌丝生长速率。
1.2.5拮抗实验
将测定菌接种于PDA液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养3 d～5 d。菌悬液离心（12000r/min），取上清，4℃保存备用，用琼脂扩散法[6]，拮抗反应的形态特征隆起型、沟型、隔离型按GB/T12728《食用菌术语》[7]规定的定义判定。
1.2.6纤维素酶活力测定
对培养袋定期取样，每次取样样本重量相同，均为20.0 g，加40 mL生理盐水，迅速封口，在（40±1）℃水浴中提取酶液，过滤，吸取酶液3 mL，用3，5－二硝基水杨法[8]测定菌丝生长阶段和出茹阶段的纤维素酶活力。
1.2.7多糖的测定
从栽培场地中取代表性的子实体,去杂后精确称取4.00 g，加少量热水浸泡2 h。反复用滤纸吸干多余水分，加50 mL蒸馏水，进行高压浸提（0.1 MPa，121℃）30 min。滤过取清液，用Seveg法去杂质，5倍冰冻乙醇沉淀多糖。用蒽酮比色法在550 nm波长下测定OD值由标准曲线查算还原糖含量[9]。