根际细菌菌株可提高辣、及花生种子发芽率，促进幼苗生长
3结果与分析
3.1 3株茶树根际细菌浸种对辣椒种子萌发及幼苗生长的影响
利用从茶树根际分离、筛选到的3株细菌菌株GD 3、KKS-6-N 1及P 5对辣椒进行浸种试验，萌发后于盆栽条件下继续生长30 d后测定幼苗的相应生长指标。以3株细菌菌液进行了2 h的浸种处理后，辣椒种子的萌发率均在90%左右，较对照显著提高了近20%，但不同菌株处理之间并无显著性差异(p<0.05)。30 d的盆栽实验表明，与对照相比，GD 3、KKS-6-N 1、P 5浸种处理的辣椒幼苗鲜重分别增加54.55%、63.64%和45.46%，株高分别增长85.14%、75.23%和84.69%，根长分别增长了69.51%、13.17%和129.76%。显然，3株茶树根际细菌的浸种处理使辣椒种子的发芽率明显提高，且对辣椒的株高和鲜重具有显著促生作用；其中，P 5浸种处理的植株根长明显高于对照及其余2个菌株的处理。
3.2 3株茶树根际细菌浸种对花生种子萌发的影响
利用3株茶树根际细菌菌株对花生进行相同的浸种处理，3 d后统计种子的萌发率(图1)，结果发现，菌剂浸种处理组的发芽率均在90%以上，较对照种子的发芽率提高了20%以上，3株细菌菌株对种子的萌发具有明显的促进效果，但不同菌株处理之间对种子萌发率并无显著差异(图1)。
图1 3株茶树根际细菌对花生种子萌发的影响
3.3 3株茶树根际细菌灌根处理对花生幼苗生长的影响
为了进一步探讨根际细菌对花生幼苗生长的影响作用及内在机制，分别利用3株菌液进行灌根处理，培育30 d后测定花生的生长性状(表2)，发现3株菌株对花生幼苗生长的影响呈现一定差异。与对照相比，GD 3、KKS-6-N 1、P 5灌根处理的花生幼苗鲜重分别增长4.63%、26.83%和35.12%，株高分别增加了5.99%、16.22%和32.73%，根重分别增长21.62%、29.73%和35.14%。生理指标的测定结果显示，GD 3和KKS-6-N 1接种组的叶绿素含量略低于对照，而P 5接种组的叶绿素含量较对照提高了13.47%。结果(图2)表明，P 5菌株的灌根处理对花生幼苗的促生效果显著，其次为KKS-6-N 1。
表2 3株茶树根际细菌对花生幼苗生长的影响
3.4 P 5菌株灌根处理对花生植株营养元素的影响
由于P 5菌株可以显著促进花生幼苗鲜重和株高的增加，因而经P 5灌根处理的花生植株进行了营养指标测定(表3)，发现接种组植株的全氮增高了13.56%，与对照呈现显著差异；全钾含量略有提升，但差异不明显，而全磷含量基本无改变(p<0.05)。
注：图左3株花生为P 5菌株处理，图右3株为ck。图2根际促生菌菌株P 5对花生幼苗生长的影响
表3根际促生菌菌株P 5对花生植株营养元素的影响
3.5 P 5菌株灌根处理对花生根际土壤三大菌群和功能菌群数量的影响
由于土壤微生物在土壤营养物质循环及维持土壤肥力方面起着重要作用，实验拟进一步从土壤菌群数量和土壤酶活入手，解析该菌株对花生的促生机制。对P 5菌株灌根处理的花生根际土壤及对照土壤进行三大菌群总数的测定(表4)，结果发现，处理组根际土壤中的细菌总数较对照增长了2.63倍，真菌总数增长了2倍，细菌数/真菌数之比增加了1.32倍，菌剂处理使得细菌和真菌数量较对照呈现显著差异，而放线菌总数并无明显差异(p<0.05)。由于P 5处理后的花生根际土壤中细菌总数显著提高，因而对根际土壤中与促生相关的功能菌群数量进行了测定(表4)，发现氨化细菌及固氮菌数分别较对照增高了2倍和2.44倍，溶磷菌数增高了4.07倍，与土壤氮磷含量直接相关的氨化细菌、固氮菌及溶磷菌数均明显高于对照，而解钾菌数略有下降，但差异不显著(p<0.05)。
3.6 P 5菌株灌根处理对花生根际土壤酶活性的影响
酶活性的测定结果(表5)显示，与对照相比，处理组根际土壤的蔗糖酶活性增加了1.41倍，过氧化氢酶活性增长了2.65倍，脲酶增长了2.33倍，中性磷酸酶活性基本无改变，表明P 5浸种处理的花生根际土壤中，蔗糖酶、过氧化氢酶及脲酶酶活性均较对照有显著提高(p<0.05)。
表6 P 5菌株的16 S rRNA基因相似性比对
图3 P 5菌株的16 S rRNA基因系统发育树
表4根际促生菌菌株P 5对花生根际土壤三大菌群数量(cfu·g-1)的影响
表5根际促生菌菌株P 5对花生根际土壤酶活性的影响
3.7 P 5菌株的分子鉴定及系统发育树的构建
利用细菌16 S rRNA基因的通用引物对27 F/1492 R对P 5细菌的总DNA进行PCR扩增，测序结果获得1 405 bp的核苷酸序列，经NCBI网站上进行BLAST比对，发现与其一致性最高的菌株为克雷伯氏菌属、变栖克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)，与该种A 6128菌株的16 S rRNA基因相似性为99.93%，此外与多株变栖克雷伯氏菌菌株及肺炎克雷伯氏菌NKU_Kleb 8 A 7菌株的相似性均为99.86%(表6)。与同属内的不同种构建系统发育树(图3)，可见P 5菌株与Klebsiellavariicola的不同菌株聚于一大枝，且与该种DX 120 E菌株(CP 009274)的16 S rRNA基因在系统树上相邻，因而结合分子鉴定及系统发育树，可将P 5菌株鉴定为Klebsiellasp.。
4结论与讨论
本研究中使用的3株细菌菌株GD 3、KKS-6-N 1和P 5均是从茶树根际分离筛选获得的，浸种试验表明，3株细菌均可使辣椒及花生种子的发芽率达到90%以上，较对照相比，发芽率可提高20%左右，对辣椒及花生种子的萌发均具有显著的促进作用。在农业生产上，目前的花生栽培通常是种子经拌种或包衣后进行播种，利用菌剂进行种子包衣处理不失为一个提高种子萌发的有效方式。而辣椒种子常因成熟度不够、采种技术不当或贮藏方法等原因造成发芽率降低[22]，研究结果为利用3株细菌菌剂进行拌种或包衣处理奠定了基础。
但是，促进种子萌发的菌株不一定会对植株的生长有显著促进作用。张振建等报道，乌拉尔杆菌PN 133和土壤根瘤杆菌Y 42的浸种均可使苋菜和油麦菜的发芽率提高，而灌根处理则促生效果并不明显[23]。利用2株溶磷菌进行青稞种子的萌发试验中，菌株10 BN-11对增加青稞发芽率及促进生长效果明显，菌株12-BN-6对株高、根长和鲜重具有明显的促进作用，但可抑制种子的萌发[24]。王艳燕等的研究发现，在9种可促进辣椒发芽率提高的菌株中，后续的穴盘育苗有促生效果的仅有4株菌，其中对辣椒下胚轴和主根长度影响显著的GH 6-1和GH 5-3并未在苗期表现出显著的促生作用，说明有些菌虽能促进种子萌发，但未必能在后期幼苗生长过程中促进其对养分的吸收[25]。本研究的浸种实验虽显示3株细菌均可明显提高辣椒和花生种子的发芽率，且不同菌株的处理并无显著差异；但辣椒种子萌发后的生长过程中，3株细菌对其后续的影响略有不一致；而且，在利用菌液的灌根处理中，发现P 5菌株对花生幼苗的促生效果显著高于KKS-6-N 1，GD 3对幼苗株高及鲜重的影响则并不明显，这也与报道的相一致。因而对于根际细菌促生作用的研究中，有必要分别对种子萌发和幼苗生长进行研究，综合评判根际细菌菌株的促生作用。
研究显示，根际促生菌可提高种子的发芽率和芽长，进而提高植株的生物量，但植物对所分离的功能菌株是否具有根际效应，是菌株发挥功能的关键[26]。康贻军等在评价PseudomonaschlororaphisRA 6和BacilluspumilusWP 8浸种和拌土对豇豆生长的作用时，发现菌液的浸种处理及108cfu·g-1剂量的菌株拌土处理均可显著提高豇豆的株高，认为浸种处理从原理上讲，应该不会对非根际土壤产生较大影响[27]。Probanza等研究表明，PGPR对植物土壤中土著微生物数量及群落结构的影响可能是其促生的另一个机制[28]。研究表明，土壤酶活性与土壤速效养分密切相关，而土壤微生物数量大、繁殖快、活性强，直接影响到植物根际有机质的分解和养分的转化[29]。因而，为了进一步解析和探究P 5菌株对花生幼苗生长的促进机制，本研究对接种P 5菌株的花生根际土壤进行了土壤微生物及酶活的测定。由于细菌、放线菌和真菌是土壤微生物的三大类群，构成了土壤微生物的主要生物量，它们的区系组成和数量变化能反映土壤生物活性水平[30]。
研究结果显示，P 5处理组根际土壤中的细菌总数较对照增长了2.63倍，真菌总数增长了2倍，细菌总数/真菌总数之比增加了1.32倍，而放线菌总数并无明显差异(p<0.05)。多数报道表明，接种促生菌均可不同程度地提高土壤细菌总数和放线菌数，降低真菌数量[31-33]。王兴祥等研究认为，细菌型土壤是土壤肥力提高的一个生物指标，真菌型土壤是地力衰竭的标志[34]。但在巨尾桉接种固氮菌或解钾菌的土壤中，发现细菌及放线菌数量增多，而真菌数量均不同程度的增高[35]。在研究中，真菌数量虽有明显提高，但细菌数/真菌数之比仍高于对照，接种组土壤仍表现为细菌型土壤。土壤酶活性在一定程度上可以反映土壤肥力状况。土壤蔗糖酶活性强弱能反映土壤的熟化程度和肥力水平[36]，过氧化氢酶活性与土壤呼吸作用及土壤微生物活动密切相关[37]，脲酶活性可在一定水平上反映土壤的供氮水平与能力[38]，磷酸酶在土壤有机磷向无机磷的分解转化方面起着重要作用[39]。
研究显示，除中性磷酸酶外，P 5接种组的根际土壤蔗糖酶、脲酶及过氧化氢酶均显著高于对照，表明根际细菌P 5的处理活跃了土壤微生物；对功能菌群数量的进一步测定结果表明，氨化细菌数、固氮菌数及溶磷菌数显著增高(p<0.05)。氨化细菌及固氮菌数量的显著提高可以提供植物更多所需的氨氮，接种组植株全氮含量的明显提高与土壤脲酶等酶活性的增高、氨化细菌及固氮菌数的显著提升相一致，这显然是促进花生生长的原因之一。
多项研究也已证实土壤酶活性与大豆、小麦及玉米产量呈显著正相关关系[40-41]。此外，P 5菌株经分子鉴定为克雷伯氏菌属，与KlebsiellavariicolaDX 120 E的同源性最高；而Klebsiellavariicola是2004年才发现的新种，作为内生菌，并由于其优良的固氮性能被报道[42-43]；本研究中的P 5菌株是具有一定固氮能力的茶树根际细菌，因而接种了克雷伯氏菌属的P 5菌株后，显著提升了花生的全氮含量。值得注意的是，P 5菌株处理的花生全磷含量与对照基本无差异，这与根际土壤中性磷酸酶活无显著变化相一致，而溶磷菌数明显增高的原因还有待进一步研究。
综上所述，Klebsiellasp.P 5菌株的浸种处理可以显著促进辣椒和花生种子的萌发，灌根处理可以显著促进花生幼苗的生长，植株的全氮含量明显提高，这与根际土壤氨化细菌及固氮菌数量的显著增多，土壤蔗糖酶、脲酶及过氧化氢酶活性的显著增高直接相关，研究结果为下一步利用P 5菌株进行拌种或田间施用奠定了理论基础。