2结果

2.1产脂肪酶菌株的筛选

从罗丹明B初筛固体培养基上筛选得到10株水解圈较大的菌株，这些菌株在350 nm紫外灯下观察，在菌落周围均有明显的橙黄色荧光圈（图1）。重复3次摇瓶发酵后，10株菌的产脂肪酶活性存在一定的差异（表1），其中菌株LD-1302的产脂肪酶活性最高，酶活达（22.58±0.09）U/mL。发酵24 h后，LD-1302培养基表面存在不溶于水且浮在水面的絮凝状乳白色蜡样物质，48 h后该絮凝状乳白色蜡样物质消失。

图1 350 nm紫外灯下产脂肪酶菌落周围的橙黄色荧光圈

表1 10株产脂肪酶菌株的酶活

2.2菌株鉴定结果

2.2.1菌落形态及镜检

LD-1302菌落形状不规则、凸面、白色不透明、边缘为毛发状；革兰氏染色镜检呈紫色，为G+菌；芽孢染色镜检可观察到绿色的芽孢、显红色的营养体。

2.2.216S rDNA序列测定与分析

以菌株LD-1302的DNA为模版，经细菌16SrDNA通用引物扩增获得序列长度为1 512 bp的基因片段，对其测序并提交Genbank核酸序列数据库。同源性分析结果表明，菌株LD-1302的16S rDNA基因序列与Genbank中的BCRC 15413等15株芽孢杆菌属细菌的同源性达99.9%以上，利用MEGA 6.1构建系统进化树，结果表明该菌株与地衣芽孢杆菌B.licheniformis聚为一支（图2）。初步鉴定菌株LD-1302为地衣芽孢杆菌。

2.2.3生理生化鉴定

菌株LD-1302可于55℃下生长、淀粉水解试验菌落四周出现无色透明圈、明胶水解培养基出现液化现象、V-P试验培养基显红色、V-P试验培养基的终pH显酸性、柠檬酸盐及丙酸盐培养基显蓝色、均可在NaCl 5%、NaCl 7%的肉汤培养基中生长、在pH5.7、pH6.8的肉汤培养基中生长良好，符合对地衣芽孢杆菌的描述（东秀珠等，2001）。结合革兰氏染色、芽孢染色及16S rDNA序列测定与分析结果，鉴定菌株LD-1302为地衣芽孢杆菌。

图2菌株LD-1302的16S rDNA序列系统发育树

2.3活菌总数计数

地衣芽孢杆菌LD-1302在以橄榄油为唯一碳源的生长培养基中延滞期较短，培养6 h活菌总数达到最高，为（94.67±3.21）×106CFU/mL，LD-1302在6～20 h内生长较为稳定，表明该菌株可利用有机碳源橄榄油，并在6 h时将培养基营养物质基本消耗殆尽（图3）。

图3菌株LD-1302的生长曲线

2.4接种量对LD-1302产酶活性的优化

由图4可知：以橄榄油为碳源时，菌株LD-1302的最适接种量为1.50%，即菌株起始接种浓度为3.75×105CFU/mL时，产脂肪酶活性最高，酶活可达到（31.64±0.34）U/mL，且在最少接种浓度为1.25×105CFU/mL时，也存在较高的产脂肪酶活性。采用SPSS 18.0统计软件分析数据可知：接种量P=0.00<0.01、时间P=0.001<0.01，表明接种量、时间均对酶活影响极显著；由接种量-酶活的同类子集结果可知：接种量为0.50%、2.50%时，酶活均值分别为15.35 U/mL、17.87 U/mL，在同一子集中，表明两者对产脂肪酶活无明显差异；接种量为1.00%、2.00%时，酶活均值分别为20.68 U/mL、19.02 U/mL，在同一子集中，表明两者对产脂肪酶活无明显差异，但产酶效果优于前两者；接种量为1.50%时，酶活均值为26.53 U/mL，与前四者分属不同子集，表明为接种量为1.50%时，产脂肪酶效果最好；由时间-酶活的同类子集结果可知：72 h时，酶活均值为17.72 U/mL，24 h、48 h时，酶活均值分别为21.35 U/mL、20.60 U/mL，在同一子集中，表明两者对产脂肪酶活无明显差异，但产脂肪酶活优于前者。

2.5碳源对LD-1302产酶活性的影响

图4接种量对LD-1302利用橄榄油产脂肪酶的影

由图5可知：最适接种量的LD-1302经橄榄油、椰子油、葵花籽油诱导，最高产脂肪酶活分别为（23.42±0.84）U/mL、（10.76±0.51）U/mL、（9.77±0.51）U/mL。采用SPSS 18.0统计软件分析数据可知：碳源、时间的P=0.00<0.01，表明碳源、时间均对酶活影响极显著；由碳源-酶活的同类子集结果可知：以椰子油、葵花籽油为碳源时，酶活均值均为8.51 U/mL，在同一子集中，表明两者对产脂肪酶活无明显差异，而以橄榄油为碳源时，酶活均值为17.54 U/mL，与椰子油、葵花籽油分属不同子集，表明以橄榄油为碳源时，产脂肪酶效果最好；由时间-酶活的同类子集结果可知：24 h、72 h时，酶活均值分别为10.84 U/mL、9.06 U/mL，在同一子集中，表明两者对产脂肪酶活无明显差异，48 h时，酶活均值为14.66 U/mL，与前两者分属不同子集，表明48 h时，产脂肪酶活效果最好；同时椰子油、葵花籽油也可诱导该菌株产生较高的酶活。

图5碳源对产酶的影响

产脂肪酶地衣芽孢杆菌LD-1302筛选、培养基及产酶条件研究（一）

产脂肪酶地衣芽孢杆菌LD-1302筛选、培养基及产酶条件研究（二）

产脂肪酶地衣芽孢杆菌LD-1302筛选、培养基及产酶条件研究（三）

产脂肪酶地衣芽孢杆菌LD-1302筛选、培养基及产酶条件研究（四）

产脂肪酶地衣芽孢杆菌LD-1302筛选、培养基及产酶条件研究（五）

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