烟曲霉生长曲线变化与致死温度研究
侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)是一种严重威胁生命的疾病，在白血病和骨髓移植受者等免疫受损机体中病死率超过90%。烟曲霉是引起IA的最主要致病菌，约占90%，目前其对人体的致病机制尚不清楚。无论是在外界环境中还是进入机体内，烟曲霉都面临生存环境的变化，这些变化统称为应激，其中生存环境温度的变化是烟曲霉面临的最基本的应激。温度是影响微生物生长的重要因素之一，不同物种对环境温度变化具有不同的适应能力。
烟曲霉是什么菌？
烟曲霉被认为是一种耐热真菌，这种特性使其对环境变化的抵抗力更强。有研究发现，在30～42℃间，烟曲霉都能较好的生长，此外，在对肥料发酵的研究中发现，烟曲霉能抵御60～80℃高温。但是，对于烟曲霉耐受高温的程度在以往研究中并没有确切的描述。
本研究通过测定烟曲霉在不同温度下的生长曲线及其在更高温度下的存活率，确定烟曲霉的最适生长温度、最高生长温度及致死温度，从而对烟曲霉耐高温生长的生理学特性有更准确的认识。
丝状真菌的生长可分为5个阶段，分别是静止期、第一过渡期、对数生长期、第二过渡期及稳定期。在第一过渡期时，孢子开始肿胀发芽，但菌丝延长不明显，生长曲线较平滑，表现出缓慢上升趋势;当处于对数生长期时，菌丝生长速度最快，生长曲线达到最大斜率;当处于第二过渡期时，菌丝延伸速度下降，生长曲线斜率下降，再次变得平滑。生长曲线能够直观的反映出丝状真菌的生长情况，因此，我们应用生长曲线法评价烟曲霉的生长状况。我们选用了三种研究曲霉生理特性时较常用的培养基:YG培养基营养丰富，除了必需成分外，还含有微量元素和维生素，特别利于菌株生长;MM培养基成分与察氏培养基类似，但严格限定了pH值，在研究不同营养成分、不同酸碱环境对菌株生长的影响时可以精确改变营养条件;YNB培养基中无碳源，可以用来研究菌株对不同碳源的利用情况。在我们的研究中发现，相同温度下，YG培养基中测得的生长曲线能更完整的反映出烟曲霉的生长周期，最适宜用来观察温度对烟曲霉生长的影响。
图1两株烟曲霉菌株在不同培养基中的生长曲线(MM.曲霉基础培养基，YNB.酵母氮源基础培养基，YG.酵母浸膏培养基)图2烟曲霉在不同温度下的生长曲线:a.AF293，b.DAL图3两株烟曲霉菌株在高温下的活力曲线
虽然研究普遍认为烟曲霉是一种耐热真菌，但对其耐受高温的程度，并没有确切的描述。我们发现，在YG培养基中，烟曲霉的最适宜生长温度为37℃，在此温度下其生长最好。这也是烟曲霉容易感染人体的一个重要原因。当温度达到48℃时，烟曲霉的生长受到一定程度的抑制，但在不同菌株中情况并不完全一致:在AF293中观察到，菌株的生长受到明显的抑制，第一生长过渡期延长，菌株进入对数生长期时间延长，生长曲线斜率较37℃明显下降;而在DAL中却观察到，虽然菌株第一生长过渡期延长，但进入对数生长期后，菌株的生长并未减缓。当温度达到52℃时，两株烟曲霉菌株均表现出明显的生长受抑，生长曲线斜率最小。以往关于真菌对温度耐受的研究中，多集中于30℃到37℃或42℃的温度改变引起的转录水平或蛋白水平的变化。由于烟曲霉是一种耐热真菌，研究发现30～37℃的温度改变不足以引起其与毒力相关的基因表达发生改变。因此，其后对烟曲霉热休克反应的研究多将刺激温度选为48℃［13-14］。但是我们发现，烟曲霉菌株在48℃时仍具有良好的生长能力，并且不同的菌株对48℃的反应不完全一致;当温度达到52℃时，两株烟曲霉才表现出明显的生长受抑。该结果提示，在烟曲霉对高温耐受的研究中，应该选择52℃作为刺激条件。
既往研究认为烟曲霉能够耐受肥堆的高温发酵阶段，但其致死温度不清楚。因此，本研究还测定了烟曲霉菌株的致死温度;致死温度指一定条件下和一定时间内杀死微生物的最低温度。我们发现，65℃持续刺激180 min或70℃刺激120 min可完全杀死烟曲霉。由于高于70℃的温度会使固体培养基熔化，因此我们无法得到高于70℃时烟曲霉的致死条件。这有待于在将来的研究中改进实验方法以阐明。
本研究中得到的烟曲霉最适生长温度、最高生长温度及致死温度虽然具有一定的代表性，但仍需在未来研究中扩大样本量以验证;我们的结果也提示，无论是以标准菌株还是临床菌株为研究对象，都需要预先了解该菌株的生理特性，以合理选择实验条件。