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RW、WK、SF发酵菌株不同组合对紫秋葡萄酒品质、香气的影响(二)

来源:食品研究与开发 发布时间:2024-11-28 17:33:45 浏览:68 次

1、材料与方法


1.1主要材料与试剂


紫秋葡萄:产自湖南怀化;皂土、白砂糖:市售;异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus,WK)、扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera,SF):湖北工业大学生物工程与食品学院实验室筛选得到;果酒专用酵母(RW):安琪酵母股份有限公司。


氯化钠、偏重亚硫酸钾、葡萄糖、磷酸二氢氨、磷酸二氢钾、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、氢氧化钠(均为分析纯):成都市科龙化工试剂厂;酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸(均为色谱纯):南京源植生物科技有限公司;果胶酶(30 000 U/g):北京索莱宝科技有限公司;2-乙基丁酸、乙酸正丁酯:美国Sigma-Aldrich公司;酵母提取物、蛋白胨、琼脂粉:国药集团化学试剂有限公司。


酵母膏蛋白胨液体培养基:酵母提取物10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,定容至1 L。


酵母膏蛋白胨固体培养基:酵母提取物10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,琼脂粉20 g,定容至1 L。


1.2主要仪器与设备


DH4000BⅡ电热恒温培养箱:天津市泰斯特仪器有限公司;7890A-5975B气相色谱质谱联用仪、1260 Infinity II高效液相色谱仪:美国Agilent公司;Super Alcomat高精度数显酒精浓度计:上海点将精密仪器有限公司;5424R高速冷冻离心机:德国Eppendorf公司;µCount3D立体计数仪,丹麦Biosense公司;T6可见分光光度计:北京普析通用仪器有限公司;57328-U顶空固相微萃取仪:上海安谱科学仪器有限公司。


1.3试验条件


1.3.1发酵工艺


葡萄原料→除梗破碎→酶解→冷浸渍→调糖→酵母活化→接种酵母→前发酵→过滤→后发酵→陈酿→灭菌→灌装→成品。


1.3.2操作要点


葡萄原料:挑选大小一致,无病虫害、无霉变的成熟紫秋葡萄。


酶解:葡萄破碎后立即按1 g/100 L加入果胶酶(30 000 U/g),同时按60 mg/L加入偏重亚硫酸钾。


冷浸渍:浸渍温度5~8℃,浸渍时间24 h。


调糖:用白砂糖调节初始糖度至22%。


酵母活化:挑取平板上的WK与SF单菌落,分别接种到装有酵母膏蛋白胨的液体培养基中,装液量为150 mL/250 mL,于28℃、150 r/min培养36 h(此时菌体浓度应达到1×108 CFU/mL)备用;准确称取10 g RW活性干酵母,按照酵母、葡萄糖与水体积比为1∶1∶10的比例进行混合,在35℃条件下静置30 min,再加入10倍体积的紫秋葡萄汁,在28℃电热恒温培养箱中培养24 h备用。


接种酵母:1)单独发酵:WK、SF与RW酵母接种量均为1%;2)混合发酵:WK与SF(以WK+SF表示)、RW与SF(以SF+RW表示)、RW与WK(以WK+RW表示)混合接种时酵母接种比例为1∶1(体积比),总接种量为1%。


前发酵:发酵容器为不锈钢发酵罐,体积为12 L,装液量75%,发酵温度24℃,发酵时间9 d。


过滤:用四层脱脂纱布进行过滤。


后发酵:发酵温度15℃,发酵时间15 d,装液量90%。


陈酿:陈酿时加入皂土用于澄清,用量10 g/L,陈酿温度5℃,陈酿时间30 d,装液量90%。


灭菌:70℃灭菌15 min。


1.3.3菌体数量测定


酵母计数方法采用µCount3D立体计数仪,酵母在TSB中生长过夜。使用0.2 µm过滤器对10 mL 0.9%NaCl缓冲液进行无菌过滤,以去除缓冲液中的颗粒。一夜之间,酵母在Eppendorf管中稀释100倍,达到所需的起始浓度约1×107。使用µCassetteB,65 µL/室(BioSense Solutions,Farum,Denmark)测量酵母浓度,一式三份。使用µCount3D算法:细菌。实验起始浓度测量为6.97×106,样品离心管标记为“1”。对于IntuGrow平板计数,将试管“1”进一步稀释,以达到预期的20-100个菌落计数。


1.3.4理化指标测定


还原糖含量的测定采用滴定法,总酸含量的测定采用酸碱滴定法,具体步骤参考白梦洋等的方法;酒精度参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》的方法测定;总酚含量的检测采用可见分光光度法,具体步骤参照陈红梅等的方法;花色苷的检测采用pH示差法,具体步骤参考刘彩婷等的方法。


1.3.5有机酸检测


有机酸检测参照刘晓燕等的方法并稍作修改,色谱柱:Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:体积分数1%的甲醇溶液和0.02 mol/L KH2PO4溶液(二者体积比3∶97),用磷酸调节pH值至2.8;等度洗脱;流速0.8 mL/min;柱温30℃;进样体积10μL;波长210 nm。


标准曲线制作:分别称取酒石酸、苹果酸、乳酸与柠檬酸有机酸标准品10 mg,用流动相定容至10 mL,得到各标准品浓度为1 mg/mL的混合标准溶液,梯度稀释为1.00、0.50、0.25、0.10、0.05 mg/mL的混合标准溶液,于4℃下保存备用。


样品测定:准确称取25 mL葡萄汁或酒液,加入0.01 mol/L磷酸二氢氨试剂,定容至250 mL,取50 mL在4 000 r/min下离心10 min。取上清液,使用0.22μm滤膜过滤,将滤液装入2 mL的进样瓶中,装液量为1 mL,等待上机测定。有机酸标准曲线的回归方程及相关系数见表1。

表1 4种有机酸标准曲线的回归方程及相关系数


1.3.6挥发性成分检测


顶空固相微萃取条件:取5 mL葡萄酒于顶空瓶中,加入2 g NaCl,再加入50μL乙酸正丁酯(8.4 mg/mL)与50μL 2-乙基丁酸(9.2 mg/mL)作为混合内标,置于55℃的顶空固相微萃取仪中平衡15 min,将老化后的固相微萃取针头插入平衡后的样品顶空萃取30 min。


色谱条件:色谱柱DB WAX(60 m×0.25 mm×0.25μm);载气为高纯He,流速1 mL/min,进样口温度230℃;采用不分流进样模式。程序升温:初始温度为40℃保持2 min,然后以5℃/min的升温速率升至90℃保持2 min,再以20℃/min的速率升至230℃,保持5 min。


质谱条件:70 eV电子能量,全扫描质量范围20~550 amu,离子源温度230℃,传输线温度280℃;四极杆温度150℃。


1.3.7感官分析


参照Englezos等和Wang等的操作方法并稍作修改。评价小组由15名感官评价人员组成(7男8女,年龄25~35岁),在通风良好、无异味的品酒室进行葡萄酒品评相关培训并组成评定小组。葡萄酒香气描述词汇为果香、花香、发酵香、草本香、甜香和整体香气强度,评分选取10分制(0为没气味,10为气味最强):0~<3低强度,3~<6中等强度,6~10高强度。结果以雷达图呈现。


1.4数据处理


使用Microsoft Excel 2016对试验所得数据进行整理,使用IBM SPSS Statistics 19.0进行显著性分析,试验结果以平均值±标准差表示,使用Origin 2020软件进行主成分分析与作图。


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