国内新发病原牛疱疹病毒4型(BoHV-4)qPCR鉴定、分离及一步生长曲线测定（一）
[目的]本文旨在对一种与奶牛繁殖障碍疾病有关的国内新发病原牛疱疹病毒4型(BoHV-4)进行检测、分离与鉴定。[方法]采集我国东北地区某养牛场疑似发生BoHV-4感染牛的生殖道拭子，将阳性样本接种HeLa细胞分离病毒，通过特异性qPCR、间接免疫荧光(IFA)及电镜观察等方法对分离病毒进行鉴定，并测定病毒一步生长曲线。用PCR扩增病毒gB和TK基因并进行遗传进化分析。[结果]阳性样本接种细胞后盲传3代，能够产生圆缩、聚集等疱疹病毒典型细胞病变效应(CPE)，从IFA结果观察到感染病毒的细胞中出现明显的特异性绿色荧光，电镜观察感染细胞可见直径100～150 nm的病毒粒子，衣壳和囊膜结构清晰，将该毒株命名为TL01。其生长曲线显示在感染后36 h达到峰值(106.3TCID50·mL-1)。PCR扩增病毒gB和TK基因并对其序列进行遗传进化分析，发现TL01的gB基因与参考株DN599在同一分支，属于基因2型;TL01的TK基因与参考株Movar33/63同属于基因1型。[结论]本研究成功分离出1株BoHV-4毒株，为深入研究BoHV-4的生物学特性和流行病学提供参考。
引言
牛疱疹病毒4型(bovine herpesvirus 4，BoHV-4)属于疱疹病毒科丙型疱疹病毒亚科。常与牛的生殖系统疾病相关，主要致病症状包括流产、生殖道疱疹、产后子宫拉伤及配种障碍等。此外，BoHV-4也会与其他病原体混合感染引起产后疾病或慢性子宫炎，造成生产性能下降。
国外最早在20世纪60年代报道该病毒。Bartha等首次从匈牙利患有呼吸系统疾病和结膜炎的犊牛身上分离出该毒株，被命名Movar33/63。Mohanty等在美国新泽西州从有呼吸系统临床症状的牛鼻拭中分离出1株类似的病毒，命名为DN599。随后在阿根廷、西班牙、埃及等国家报道临床分离株。该病毒能够从无临床症状的动物身上分离，也能够从具有各种生殖系统疾病症状或者患有溃疡性乳腺炎和皮肤病变的牛身上分离。但在我国直到2021年才首次报道BoHV-4的存在，目前对该病毒在我国流行情况及毒株特性的研究仍十分缺乏。BoHV-4不仅可在常见的MDBK细胞内复制，而且可以在人类细胞系中复制，例如人胚胎肺细胞和HeLa细胞。
BoHV-4病毒颗粒较大(直径150～200 nm)，是有囊膜的二十面体粒子，基因组大小约144 kb。根据限制性内切酶图谱，在初期将BoHV-4分为2种基因型:Movar33/63-Like型和DN599-Like型。2012年，研究人员对从阿根廷流产奶牛的宫颈阴道黏液中分离出的BoHV-4毒株进行分析时发现，MGA1075株和07435株具有相似的核酸内切酶图谱，但与Movar33/63-Like型和DN599-Like型均具有较大差异，因此新定义了基因3型，揭示了其复杂的遗传背景。研究发现，基于该病毒的糖蛋白(glycoprotein B，gB)和胸苷激酶(thymidin kinase，TK)基因的序列差异性，绘制出毒株的分子遗传进化树，表明gB和TK基因均可用于该病毒的基因分型，基于TK基因的进化树体系可以提供更加准确的基因分型。
本研究通过对东北地区某牧场采集到的样品进行检测与病毒分离，鉴定后以gB和TK基因为靶标进行系统发育分析，以获得该分离株的分子遗传进化信息，为该病毒的流行病学分析提供资料以及为国内BoHV-4的诊治和预防提供参考。
1材料与方法
1.1材料
生殖道拭子采自东北地区某牧场出现生殖道疱疹和繁殖障碍的病牛;HeLa细胞、BoHV-4 gB小鼠多克隆抗体由南京农业大学世界动物卫生组织猪链球菌病参考实验室保存。qPCR反应酶购自青岛立见生物科技有限公司。PCR扩增高保真酶、DNA/RNA磁珠法提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。细胞培养基DMEM购自武汉普诺赛生物科技有限公司。
1.2引物设计及合成
使用本实验室前期设计的BoHV-4、BoHV-1、BVDV(牛病毒性腹泻病毒)的qPCR引物;同时根据GenBank中的BoHV-4全基因组序列，设计扩增gB和TK基因的特异性PCR引物。引物信息见表1，引物均由生工生物科技有限公司合成。
表1本试验所用的引物信息