327株不同种类链球菌的体外药敏试验检测方法（一）
链球菌是临床能够分离到的常见致病菌之一，尤其是肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌等，对于人类，尤其是儿童的健康存在巨大威胁。随着目前广谱抗菌药物在临床中的应用日益增多，临床上链球菌对于某些抗菌药物的耐药情况也日益严重。因此，临床分离链球菌属的体外药敏试验检测显得尤为重要。目前，临床上已经有商业化的链球菌药敏检测试剂，并且已得到较为普遍的应用，但是不同厂家或不同方法学之间存在较大差异。本文通过考察一种国产商业化链球菌药敏板与微量肉汤稀释法对327株不同种类链球菌的体外药敏试验检测，进而评估该新型商业化链球菌药敏板卡的体外药敏检测性能，以期为临床链球菌属引起的感染性疾病提供更合理的用药指导。
1 材料与方法
1.1材料
收集2018-2019年来源于郑州市中心医院、郑州市人民医院、南阳市中心医院和河南省人民医院的327株链球菌属临床菌株，包括肺炎链球菌107株，化脓链球菌41株，缓症链球菌51株，无乳链球菌55株，停乳链球菌7株，星座链球菌13株，咽颊炎链球菌15株，草绿色链球菌8株，中间链球菌22株，血链球菌8株。标准菌株：肺炎链球菌(ATCC49619)。
1.2仪器与试剂
上海精科科技公司的酸度计，厦门致微公司的高压灭菌锅，瑞士METTLER TOLEDO公司的电子天平，金坛市科析仪器公司的振荡仪，上海跃进公司的恒温培养箱，法国生物梅里埃公司的比浊仪，美国SIGMA公司的快速离心机，中国海尔集团的-20 ℃冰箱，美国Thermo公司的移液器，美仑生物科技公司的头孢曲松、利福平、氨苄西林、头孢呋辛、美罗培南、青霉素、氯霉素、头孢噻肟、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、四环素、利奈唑胺、替加环素、左氧氟沙星、克林霉素、莫西沙星、甲氧苄啶、复方磺胺甲噁唑、万古霉素、红霉素抗菌药物标准品，购自Oxoid公司的M-H干粉、脱纤维绵羊血、矿物油，血琼脂平板(郑州安图生物工程股份有限公司)，链球菌药敏检测试剂盒(比色/比浊法，郑州安图生物工程股份有限公司)，洛阳昊华公司的无水乙醇，国药集团公司的二甲基亚砜。
1.3方法
使用血琼脂平板对质控菌株和临床菌株进行活化，利用0.85%生理盐水将各临床菌株制备成0.5麦氏单位的菌悬液，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)《需氧菌的稀释法药敏试验方法》关于链球菌属细菌药敏试验所用培养基制备的规定，将M-H干粉按照要求的量充分溶解并调节pH值至7.0左右，121 ℃高温高压灭菌15 min，灭菌的M-H肉汤冷却后，添加2.5%～5.0%的脱纤维绵羊血，混匀后备用。分别称取头孢噻肟等20种抗菌药物标准品，根据需要考核试剂的各种抗菌药物浓度分布及CLSI标准对于肉汤稀释法操作过程的严格规定，使用合适的溶解试剂进行抗菌药物的溶解并加入96孔板内，每孔加入10 μL的10倍于检测浓度的抗菌药物溶解液，并使用大型真空干燥箱进行快速干燥处理，保存备用。
微量肉汤稀释法操作：取90 μL加血M-H肉汤加入96孔酶标板，将板立即置于Bioscreen C自动微生物生长曲线分析系统上。；每种抗菌药物进行3次平行试验，将已制得的0.5麦氏单位质控菌悬液稀释200倍后，各取10 μL加入酶标板各孔内，滴加1滴矿物油液封并置于35～37 ℃温箱内培养24 h。待评价链球菌药敏试剂盒操作过程：取出1瓶培养液，向其中添加1滴显色液和100 μL菌悬液，混匀后向120孔链球菌药敏板每孔加入100 μL菌悬液，滴加矿物油后盖上盖子置于35～37 ℃温箱内培养24 h。两种操作均要求首先进行肺炎链球菌(ATCC49619)的质控，合格后才能进行临床菌株试验。依据CLSI文件M100-S29标准，对药敏试验结果和敏感性结果进行记录和统计分析。
1.4统计学处理
对两种方法所测得的最小抑菌浓度(MIC)结果及菌株敏感性结果按照菌株分类进行统计学分析，采用SPSS23.0统计软件对数据进行分析处理。计数资料以例数或百分率表示，采用χ2检验进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。根据CLSI的M52标准进行菌株敏感性比较分析；统计出3种方法的基本一致性(EA，即不同MIC测定方法在±1个稀释倍数范围内的结果一致性)和分类一致性(CA，即不同方法测定的菌株对抗菌药物敏感性的一致性)，另外，对于菌株敏感性，需要进行非常重大误差(VME，即耐药误判为敏感)、重大误差(ME，即敏感误判为耐药)和微小误差(mE，即中介报告为敏感或耐药)结果的测定。美国食品药品监督管理局标准规定指出，CA≥90%、EA≥90%、VME≤1.50%、ME≤3.00%、mE<3.00%为可接受范围。
2 结 果
2.1考核试剂盒与微量肉汤稀释法EA测定结果
统计链球菌药敏试剂盒与微量肉汤稀释法的检测结果，对其EA进行统计分析，按照CLSI标准对于不同方法学结果差异的规定，不同测定方法的MIC差值≤1个倍比梯度认为是正确测定值。EA检测结果见表1。新型链球菌药敏板与“金标准”微量肉汤稀释法共测定327株链球菌的体外药敏检测，在EA方面，按照测试结果总量统计，新型链球菌药敏板与微量肉汤稀释结果差异在±1个稀释倍数内的整体符合结果个数/总结果个数为6 509/6 540，整体EA为99.53%。对于所涵盖的抗菌药物种类：头孢曲松、利福平、头孢呋辛、青霉素、氯霉素、头孢噻肟、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、四环素、利奈唑胺、替加环素、左氧氟沙星、克林霉素、莫西沙星、万古霉素、红霉素的EA均为100.00%；氨苄西林EA为97.86%；美罗培南EA为96.94%；复方磺胺甲噁唑EA为97.55%；红霉素/克林霉素诱导试验EA为98.17%；对于所测临床菌株，随机选取10株进行结果重复性测试，检测结果与已测结果一致。
表1 考核试剂盒与微量肉汤稀释法EA测定结果
2.2考核试剂盒与微量肉汤稀释法CA测定结果
对两种测定方法的体外药敏检测的CA进行统计，结果表明，新型链球菌药敏板与“金标准”微量肉汤稀释法测定共进行327株链球菌的体外药敏检测，两种方法的整体CA为97.40%，VME为0.09%，ME为0.59%，mE为1.92%。新型链球菌药敏板与“金标准”微量肉汤稀释法的CA测定结果差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 考核试剂盒与微量肉汤稀释法CA测定结果[n(%)]
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