基于刃天青微量板法检测沙门氏菌抗生素的耐药性（一）
摘要采用刃天青微量板法检测多株沙门氏菌对抗生素的耐药性，得到最小抑菌浓度（MIC）。通过肉眼观察和荧光检测都可判定沙门氏菌的耐药性，判定时间仅需5 h，刃天青法与微量肉汤稀释法检测得到的耐药性结果一致。其中用颜色观察能更清晰明确地分辨出耐药折点，荧光检测可以动态地反映细菌随时间变化的生长情况。刃天青微量板法具有简便、快速、灵敏度高的特点，能确定抗生素的耐药性和精确耐药MIC值。
沙門氏菌（Salmonella）作为一种食源性病原体，对人类健康构成了巨大威胁。沙门氏菌可通过受污染的畜禽产品、蛋、奶乃至海洋产品感染人类。近年来，由于抗生素的广泛使用，出现了沙门氏菌耐药株和多重耐药株，导致沙门氏菌耐药性问题日益严重，对畜牧业和人类健康都构成了潜在威胁。
为了应对这种威胁，迫切需要进行抗生素敏感测试（AST），以快速诊断这些危险细菌的耐药性，确保快速、准确地使用抗生素。当前，各种传统实验室方法可用来表征微生物对抗生素的体外敏感性，如常量肉汤稀释和微量肉汤稀释法、圆盘扩散法和抗菌梯度法等。但是，这些方法多数都需要冗长的测试程序，通常需要经历收集样品、富集培养物，在这之后还至少需要孵育16 h才能进行检测。耐药细菌的流行率增加表明现在迫切需要能够在数小时而不是数天之内提供药敏性数据的AST。除了常规检测方法，mPCR法和全自动微生物分析仪测定法等新型检测技术也已运用在耐药性检测中。基于已知和赋予细菌抗性基因的扩增和检测技术，与常规培养方法相比，酶促扩增技术减少了检测时间。但这些技术需要大型且昂贵的仪器，这限制了它们在资源受限的环境中的使用。
刃天青（resazurin）作为一种氧化还原染料，活细菌可以将刃天青转化为粉红色的荧光染料试卤灵（resorufin），继续反应可以变为白色无荧光的二氢试卤灵（dihydroresorufin）。因其安全无毒、经济实惠的优点，已被越来越多地应用于细胞活力和细胞增殖能力的评估。以刃天青为指示剂的低成本药敏试验方法，能动态地反映细菌的生长情况，可以检测药物的作用时间和细菌的耐药情况。该研究采用刃天青法检测沙门氏菌对几种抗生素的敏感性，确定最佳试验条件，为沙门氏菌的快速、简便检测提供一种新方法。
1材料与方法
1.1试材
氧氟沙星（Ofloxacin）、环丙沙星（Ciprofloxacin）购自上海麦克林生化科技有限公司;氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）购自美国Sigma试剂有限公司;氨苄西林（Ampicillin）、美罗培南（Meropenem）、四环素（Tetracycline）、刃天青（Resazurin）、盐酸（HCl）购自上海国药集团;营养肉汤（NB）、营养琼脂（NA）购自上海博威生物医药有限公司。所有溶液均用超纯水制备，所有试剂均为分析纯。鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028（Salmonella typhimurium）为实验室保存菌株，其余沙门氏菌（Salmonella）分离株均来自华中农业大学，-80℃保存备用。
1.2仪器
Lab Dancer漩涡仪，IKA公司;Spectra MAX M5酶标仪，美国Molecular Devices;WGZ-XT细菌浊度仪，杭州齐威仪器有限公司;平底96孔细菌培养板， 丹麦Biosense公司;VB-40立式高温高压灭菌锅，德国SYSTEC;BSC-1300超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;SHP-150生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司;EX-OHOUS电子天平，美国奥豪斯公司;Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司。
1.3细菌培养
取沙门氏菌接种于NB培养基，在37℃摇床培养，通过细菌浊度仪检测细菌浓度。将浓度为0.5 MCF的菌液进行梯度稀释，取100μL涂布NA琼脂平板，37℃培养24 h，进行菌落计数，计算出0.5 MCF菌液对应的细菌培养物的菌落数及菌落形成单位（CFU/mL）。最后用NB将菌液稀释成所需浓度，4℃冰箱保存备用。
1.4微量肉汤稀释法药敏试验
按美国临床和实验室标准协会（CLSI）方案，将倍比稀释的不同浓度的抗生素分别加到无菌的96孔培养板中，1～11孔加入系列稀釋抗生素100μL，第12孔不加抗生素作为阳性生长对照。将培养的沙门氏菌菌悬液稀释至7.5×106 CFU/mL，向每孔中加100μL，在37℃恒温培养箱中孵育。此时，1～11孔药物浓度分别为128.000、64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125μg/mL。20 h后，观察96孔培养板中的液体浑浊情况，判断沙门氏菌是否生长及其对所试抗生素的敏感性。
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