微生物生长曲线监测仪测定纳米银对副溶血弧菌的最小抑菌浓度（一）
摘要由于河口水具有复杂的物理和化学性质，准确、高效地测定纳米银在其中的抑菌效应是个国际性挑战。本研究基于电子微生物生长曲线监测仪建立了一种自动化表型方法。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)在河口水中暴露于纳米银之后，暴露混合液直接被加进预装有Luria-Bertani液体培养基的检测管中，置入电子微生物生长曲线监测仪测定细菌的生长动力学曲线，根据细菌生长曲线判读纳米银对副溶血弧菌的最小抑菌浓度。
采用电子微生物生长曲线监测仪测定了纳米银在8个河口水样品中的抑菌效应，结果表明，所得最小抑菌浓度值都与采用经典平板计数法和微量肉汤稀释法所得结果吻合良好。较之于经典方法，所建新方法的优势在于无需去除暴露混合液中诸如悬浮颗粒之类的复杂共存物，因此操作更简便、劳动强度小，总周期缩短至少20 min，并有效降低了主观和客观操作误差风险，具有良好的精密度和重现性。
此外，电子微生物生长曲线监测仪法测得的最小抑菌浓度值通常不低于平板计数法和微量肉汤稀释法所得数值，表明该基于传感器识别结果的方法比基于视觉判别结果的方法具有更高的灵敏度。本研究为准确、高效测定纳米材料在诸如河口水之类复杂介质中的环境毒理效应提供了新手段。
纳米银(Ag NPs)具有独特的抗菌性能，是世界上最常用的纳米材料之一，广泛应用于医疗设备、化妆品、纺织品、电子、玩具和家用电器等领域。Ag NPs的广泛应用使它们不可避免地会通过废水、大气沉降和其他途径进入河流、湖泊、河口和沿海水域，引发了人们对其生态安全性的担忧。对于河口环境中纳米材料的风险评估而言，微生物(尤其是细菌)是理想的指示物。因此，准确测定纳米材料对细菌的抑制效应是进行环境风险评估活动的必要前提之一。Kirby-Bauer纸片扩散法、显微镜法、平板计数法、生物量测定法、微量肉汤稀释法(BMD)、电化学传感器、表面增强拉曼光谱法和浊度法(OD)等基于微生物生长分析的表型方法已经被广泛应用于测定纳米材料对细菌的抑制效应。
基于遗传物质分析的基因型方法(如PCR、qPCR、RT-PCR和高通量测序)由于可以节约细菌培养所需时间，近年来也发展迅速。这些表型和基因型方法在测定实验室单纯介质(如培养基)中纳米材料对微生物的影响时具有很好的性能。然而，当它们被用于测定纳米材料在真实的复杂介质(如河口水样)中对微生物的影响时，必需经过繁琐的分离、纯化等前处理步骤，不仅效率低，而且主客观误差也在所难免。
目前，准确、高效地测定实际复杂样品介质中纳米材料抑菌效应的分析方法依然是业界的急迫需求。近年来，我们团队研制出了一种基于电容耦合非接触电导(C 4)原理的多通道传感器，为在线监测微生物生长过程提供了可能。C 4检测是一种独特的电导率分析方法，工作时电极不与被测试介质直接接触，输出的信号值正比于介质导电离子浓度及介质中载流子的迁移率。它不仅具有经典接触式电化学分析技术的优点——如仪器简单、成本低廉、响应速度快、不受浊度影响、易于小型化等，而且不存在电极的极化、钝化和污染风险。我们基于该多通道传感器，研制出了32通道电子微生物生长曲线监测仪。但是，尚未曾采用EMGA建立测定河口水中纳米材料抑菌效应的方法。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)广泛存在于河口及近岸环境中，是一种条件性致病的革兰氏阴性嗜盐菌。
另一方面，它们还具有优异的异养硝化–好氧反硝化能力，能够降解碳氢化合物、木质素等一些难降解的化合物。因此，探索Ag NPs对河口水中副溶血弧菌的影响具有重要的科学意义。
本研究以副溶血弧菌为模式微生物，通过采用EMGA测定Ag NPs胁迫下细菌生长动力学曲线，建立一种分析纳米材料在河口水中抑菌效应的高效方法，探讨该方法的可靠性和实用性，并采用经典的BMD法和平板计数法进行性能验证。
1材料与方法
1.1细菌培养与计数
副溶血弧菌标准菌株(ACTT17802)购自北京百欧博伟生物技术有限公司，采用Zhang等报道的方法进行培养。Luria-Bertani(LB)培养基干粉购自青岛海博生物技术有限公司，采用超纯水制成实验用液体培养基(含0.5 g/L NaCl、10.0 g/L胰蛋白胨和5.0 g/L酵母提取物)。副溶血弧菌在LB液体培养基中接种，在Herocell C1S型培养箱(上海润度生物科技有限公司,上海)中于36℃下150 r/min轻摇预培养过夜。然后选择活性菌株，转移到新的液体培养基中。第2次培养达到指数期后(约14 h)，取出一部分用标准平板计数法测定细菌浓度(单位CFU/mL)。其余培养液以三平行进行梯度稀释备用。除特殊说明之外，本研究中使用的所有化学试剂均为分析纯。
1.2Ag NPs的制备与表征
采用Bastús等报道的湿化学法制备Ag NPs。50 mL柠檬酸钠(5 mmol/L)和单宁酸(0.25 mmol/L)的水溶液在三颈圆底烧瓶中油浴，剧烈搅拌下回流15 min。然后在溶液中注入0.5 mL 25 mmol/L的AgNO 3。关闭加热器，让反应持续10 min。冷却后，取出生成物。通过3次离心除去未反应物以纯化产物，最终获得0.80 g/L的Ag NPs纯水分散液。产物采用透射电镜、紫外-可见分光光度计(Lambda 900,PerkinElmer,美国)和粒度仪(Malvern,英国)进行形貌与性质表征。
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