罗尔阿太菌生长曲线、原生质体制备条件及融合技术（一）
摘要：【目的】选育罗尔阿太菌多糖高产，草酸低产的优良罗尔阿太菌菌株。【方法】采用原生质体融合技术，以罗尔阿太菌菌株AY6657741为原始菌株，以紫外和亚硝基胍复合诱变的2株多糖高产的诱变株Ar-1和Ar-2为双亲菌株；通过正交试验优化原生质体的制备条件。【结果和结论】5.56 mmol·L-1的β-巯基乙醇处理菌悬液，0.4 mol·L-1的KCl作为渗透压稳定剂，3.1 mg·m L-1的复合酶液（纤维素酶φ为2%，蜗牛酶φ为2%，溶壁酶φ为4%），p H 5.5，32℃酶解55min，原生质体形成率93.534%，再生率18.921%.0.4 g·m L-1的聚乙二醇6000在30℃条件下融合25 min，选育出1株多糖高产，草酸低产的菌株，命名为AY-3.菌株AY-3多糖产量达24.673 g·L-1，比原始菌株AY6657741的产糖量提高了54.42%，草酸质量浓度降低至0.281 g·L-1，比原始菌株草酸的质量浓度降低了43.57%.
罗尔阿太菌Athelia rolfsii是担子菌门阿太菌属的一种真菌，无性世代为齐整小核菌，白色菌落，菌丝呈放射状生长，能分泌多糖。该多糖是一种非离子型、水溶性的同聚多糖，包含β-D-（1→3）~吡喃葡萄糖基和β-D-（1→6）~吡喃葡萄糖基线性链。具有水溶性、组织相容性、增稠性、抗水解能力及在高温下保持黏度的特性，广泛应用于食品、药品、石油采收、陶瓷、纸张、绘画、化妆品、抗肿瘤、抗微生物及抗病毒等方面。
目前罗尔阿太菌多糖的研究主要集中在多糖的物理化学特性、分子构象、抗肿瘤活性、免疫活性及药物缓释方面，但鲜见通过选育菌种提高产糖量的报道。原生质体融合技术广泛应用于菌种选育，具有重组频率高、遗传物质完善、易获得性状优良的融合菌等优点。陈合等利用原生质体融合技术选育出高产灵芝多糖的灵芝菌；靳挺等利用原生质体融合技术选育出高产茁霉多糖的出芽短梗霉。Gunashree等利用原生质体融合技术成功地将黑曲霉和曲霉菌进行了融合。本研究以菌株AY6657741为试验材料，采用原生质体融合技术选育多糖高产草酸低产的菌株，为提高多糖产量奠定理论基础。
1材料与方法
1.1试验材料
罗尔阿太菌菌株AY6657741，由吉林农业大学发酵工程实验室分离和保藏。经紫外和亚硝基胍复合诱变获得突变菌株Ar-1和Ar-2.
溶壁酶（≥200 U·mg——1）购自上海楷洋生物技术有限公司；纤维素酶（≥10000 U·mg——1）、蜗牛酶（≥2000 U·mg——1）、KCl、NaCl，聚乙二醇（PEG）6000等试剂均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。
PDA斜面培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，121℃灭菌20 min。
种子培养基：葡萄糖20 g，酵母浸粉1.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaNO33.0 g，KCl 0.5 g，加蒸馏水定容至1 L，pH 4.55，121℃灭菌20 min。
发酵培养基：玉米淀粉35 g，玉米黄浆50 mL，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaNO33.1 g，KCl 0.5 g，柠檬酸0.4 g，加蒸馏水定容至1 L，pH 4.55，121℃灭菌20 min。
低渗培养基：蛋白胨5.0 g，琼脂15 g，牛肉浸膏3.0 g，葡萄糖10 g，酵母浸粉1.0 g，马铃薯200 g，蒸馏水定容到1 L，pH 4.55，121℃灭菌20 min。
双层再生培养基：低渗培养基中加入渗透压稳定剂（0.4 mol·L——1的KCl、NaCl、蔗糖、MgSO4），上层琼脂15 g，下层琼脂5 g，pH 4.55，121℃灭菌20 min。
1.2生长曲线的测定
将A.rolfsii AY6657741菌株接种于250 mL种子培养基中，29℃、200 r·min——1空气浴振荡培养72 h，转接入发酵培养基中，接种量为7%，29℃、200 r·min——1培养162 h.期间每6 h取出3瓶培养基，分别用HCl调节pH至7.0，用蒸馏水稀释3倍，8000 r·min——1离心15 min。弃上清液留菌丝体，80℃烘干菌丝体至恒质量，称菌丝体干质量，获得菌体生长曲线。
1.3菌悬液的制备
取斜面培养菌株，无菌水冲洗，涡旋器振荡混匀，用无菌擦镜纸滤去菌丝体片段，用无菌水稀释至终浓度为1.0×105mL——1，转接入种子培养基中，29℃、200 r·min——1振荡培养55 h。
相关新闻推荐
3、高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——摘要