鹌鹑肺炎克雷伯菌血清型鉴定、耐药性检测及致病潜力（四）
3讨论
肺炎克雷伯菌是一种重要的机会致病菌，常见于家禽、牲畜等动物体内。在禽类感染中，肺炎克雷伯菌可引起禽类腹泻、肠道炎症、出血等症状。本研究从腹泻鹌鹑粪便中分离出2株肺炎克雷伯菌Ksp-A1和Ksp-A2.通过形态学观察、生化鉴定、16SrDNA测序和系统进化树构建，确认2株分离株均为肺炎克雷伯菌，其生化特性均符合肺炎克雷伯菌的典型特征，这为进一步的分子生物学和耐药性研究提供了基础。表6各组小鼠死亡率统计结果近年来，由于规模化养殖场大量使用抗生素，耐药性问题逐渐成为一个必须攻破的难题。肺炎克雷伯菌能通过生成水解酶来抵御抗生素，这使得常见抗菌药物对肺炎克雷伯菌所致疾病的治疗难度加大。
本试验中所分离的Ksp-A1菌株携带blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat1共6种耐药基因，Ksp-A2菌株携带blaSHV、aaaA1、aacC2、oqxAB、qnrA、tetA、tetM和cat1共8种耐药基因，Ksp-A1和Ksp-A2均携带有blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat16种耐药基因，其中blaSHV基因编码一种β-内酰胺酶，该酶能水解包括青霉素类和头孢菌素类在内的多种β-内酰胺类抗菌药。oqxAB基因编码的OqxAB蛋白是一种多重耐药外排泵，其对氟喹诺酮类、喹噁啉类、氨基糖苷类和氯霉素类等多种抗菌药以及部分消毒剂类物质具有外排作用。这种耐药性的存在减少了药物在细菌细胞内的累积浓度，从而降低了药物的有效性。
tetA基因编码四环素抗性蛋白tetA,该蛋白属于主要促进因子（MFS）家族，它是一种外排泵，能利用细胞膜上的质子梯度作为能量来源来驱动抗生素的外排，可以将四环素类抗菌药从细菌细胞内部运输到外部环境中，从而减少细胞内药物的积累，使细菌对四环素类抗菌药产生耐药性。tetM基因编码的蛋白是一种核糖体保护蛋白，它能赋予细菌对四环素类抗菌药的耐药性，这种耐药性主要是通过保护细菌的核糖体免受四环素类药物的抑制作用来实现的，从而允许细菌在存在这些抗菌药物的环境中生长。cat1基因编码过氧化氢酶蛋白，其能够催化过氧化氢的分解，在控制体内活性氧平衡中起重要作用。
此外，分离株Ksp-A2独有的2种基因分别为aaaA1和qnrA,aaaA1基因是肺炎克雷伯菌中与耐药性相关的一个重要基因，是AcrAB-TolC外排泵系统的一部分。外排泵是细菌细胞膜上的蛋白质复合体，能够将进入细胞的抗生素泵出细胞外，从而减少药物在细胞内的积累，使细菌产生耐药性，包括但不限于四环素类、大环内酯类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类等。qnrA基因编码蛋白QnrA属于五肽重复家族一员，能够保护细菌的DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ免受喹诺酮类抗菌药的抑制作用。肺炎克雷伯菌侵袭宿主机体的条件与其自身荚膜多糖、菌毛、分泌的毒素等有关。
本试验对分离株进行血清型和毒力基因检测，结果显示，分离株Ksp-A1和Ksp-A2荚膜血清型均为K57,Hsu等研究报道，K57是与肺炎克雷伯菌相关的肺炎相关综合征（PLA）荚膜类型之一，这表明本研究分离株可能具有与PLA相关的临床特征。其中Ksp-A1菌株携带K88、hlyE、iucD、irp2、ompA和ompC6种毒力基因，Ksp-A2携带K88、hlyE、iucD、irp2、ompA、ompC和malX7种毒力基因。这些毒力基因在肺炎克雷伯菌和大肠杆菌致病机制中扮演着相似的角色。K88毒力基因编码K88菌毛，其赋予细菌定植能力并促进细菌黏附于宿主肠道上皮细胞，抵抗宿主的自然清除机制，并助其逃避免疫系统，引发肠道感染。hlyE基因编码的溶血素E（HlyE）能够形成跨膜孔洞，导致红细胞溶解。iucD基因编码蛋白参与气杆菌素生物合成途径，气杆菌素是一种铁载体，可以帮助细菌从宿主中获取必需的铁元素。
iucD基因高表达的细菌在与宿主细胞的竞争中具有优势，能够使致病菌更有效地获取铁元素，从而增强其自身致病性。irp2基因编码铁调节蛋白2（IRP2），它参与调节细胞内的铁代谢，IRP2通过结合铁反应元件IREs来控制铁代谢相关基因的表达。当iucD和irp2基因共同作用时可能产生协同效应，进一步增强肺炎克雷伯菌的致病性，iucD基因能帮助细菌获取铁元素，而irp2基因则能帮助细菌调节和利用这些铁元素，以支持其生长和毒性因子的产生。在肺炎克雷伯菌中，ompA和ompC基因编码的孔蛋白（Porins）是细菌外膜中的重要成分，在细菌的致病机制和耐药性中起着关键作用。ompA基因编码的OmpA蛋白是一种常见的外膜蛋白，它参与形成细菌外膜的孔道，控制分子进出。OmpA在细菌的黏附、侵袭宿主细胞以及调节细菌表面特性中发挥作用，这些特性对于肺炎克雷伯菌的致病性至关重要。
ompC基因编码的OmpC蛋白在调节细菌对外界环境的适应性和抗生素的通透性方面发挥作用。OmpC的存在可以控制抗菌药进入细菌细胞的量，从而影响细菌对某些抗菌药物的敏感性。分离株Ksp-A2还携带有malX基因，其功能尚未被充分研究，但有研究表明它可能与细菌的生物膜形成相关。本研究对分离的2株肺炎克雷伯菌进行生长特性分析，结果显示，分离株Ksp-A1和Ksp-A2均在培养2h后进入对数生长期，其中Ksp-A1在12h达到生长峰值，Ksp-A2在培养9h后到达生长峰值，这与Li等报道的在合适培养条件下，肺炎克雷伯菌生长速率和生长曲线表现出明显阶段性变化的结果相一致。酸碱耐受性试验结果显示，分离株Ksp-A1和Ksp-A2在pH4.0-9.0范围内生长较好，且pH7.0条件培养时生长状态最佳，这表明2株分离株均能适应中性环境，具备较强的生存能力，与Cheng等发现肺炎克雷伯菌中性pH条件下生长最佳的结果相符。
此外，分离株Ksp-A1和Ksp-A2的最佳接种量分别为3%和2%,显示出不同菌株在接种量上的适应性差异，这为后续的菌株应用研究提供了参考。本研究通过动物试验评估了分离株Ksp-A1和Ksp-A2的致病性，结果显示，试验组小鼠在注射后12h内出现明显的发病症状，包括被毛粗乱、精神沉郁、呼吸困难和腹泻，对照组小鼠活动正常，表明分离株Ksp-A1和Ksp-A2具有强致病性。这与Weber-Dabrowska等高感染剂量情况下肺炎克雷伯菌能够在小鼠体内迅速引发病症的研究结果一致。随着菌液浓度增加，Ksp-A1和Ksp-A2的致死率呈现明显上升趋势，且分离株Ksp-A2的致死性明显高于Ksp-A1,可能与其携带的malX毒力基因相关，这也表明毒力基因种类和数量与肺炎克雷伯菌致病性密切相关，携带特定毒力基因的菌株通常表现出更强致病能力和生存优势，尤其在宿主免疫系统压力下。
综上所述，本研究结果与国内外相关研究相符，表明不同来源肺炎克雷伯菌在致病性和毒力基因组成上存在明显差异，强调了肺炎克雷伯菌的高毒力潜力和其携带的多种毒力基因在致病过程中的重要性。试验结果不仅为研究肺炎克雷伯菌的致病机制提供依据，也为未来的疫苗开发和治疗策略制定提供重要的参考信息，后续可进一步探索相关毒力基因的功能及其在肺炎克雷伯菌感染中的具体作用，以及开发针对性的防治措施。
4结论
本研究从腹泻鹌鹑粪便中分离出2株肺炎克雷伯菌Ksp-A1和Ksp-A2,2株分离株均为K57血清型，表现出多重耐药性，携带blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat1等耐药基因，以及K88、hlyE、iucD、irp2、ompA和ompC等毒力基因，对小鼠具有致病性，且其携带的毒力基因与致病性密切相关。