皮肤科门诊甲真菌病患者的菌种分布和体外药敏试验
甲真菌病是甲及其周围组织的真菌感染，是皮肤科最常见的甲病，占甲病的50%。致病真菌包括皮肤癣菌、念珠菌等酵母菌及非皮肤癣菌性霉菌等。其中，红色毛癣菌是最常见的致病菌，约占90%。本文对我院2014年11月～2015年1月皮肤科门诊甲真菌病患者的菌种分布和体外药敏试验做一回顾性分析，为临床诊断治疗提供用药依据。
1资料与方法
1.1研究对象
受试者为我院皮肤科门诊2014年11月～2015年1月就诊的甲真菌病患者，临床表现典型者予以真菌直接镜检和真菌培养以明确诊断。登记年龄和性别等一般资料。
1.2实验室检查
刮取病甲甲屑做真菌直接镜检并同步进行真菌培养。
真菌直接镜检取甲屑置于载玻片上；加1滴15%KOH溶液，盖上盖玻片；放置片刻或酒精灯火焰微加热，即在火焰上快速过火2～3次不应沸腾；轻压盖玻片；冷却后先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察菌丝和孢子的形态、特征、位置、大小和排列等。
真菌培养鉴定甲屑标本接种在含有50μg/mL氯霉素和500μg/mL的放线菌酮的沙堡斜面培养基(SDA)上，每个样本接种2管，置于25～28℃培养14 d。丝状真菌通过菌落形态和小培养显微镜下特征鉴定；念珠菌通过转种科玛嘉念珠菌显色培养基或API20CAUX测试板条鉴定。
1.3体外药敏试验
抗真菌药物咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、联苯苄唑和特比萘芬为原药药粉，均来自Selleck Chemicals公司(咪康唑批号S253601，酮康唑批号S135302，氟康唑批号02，伊曲康唑批号S247603，联苯苄唑批号S185402，特比萘芬批号S172501)，药物纯度达99.9%。各药物浓度范围为：氟康唑0.125～64μg/mL；伊曲康唑、酮康唑、联苯苄唑和咪康唑0.03～16μg/mL；特比萘芬0.007 8～4μg/mL。
质控菌株须癣毛癣菌ATCC MYA 4439和近平滑念珠菌ATCC 22019，均来源于第二军医大学长征医院皮肤科惠赠。
试验方法皮肤癣菌参考改良的丝状真菌M38-A2方案，念珠菌参考M27-A3方案。用试管倍比稀释法制备药物稀释液10个浓度梯度，分别加入96孔板的1～10列，每孔均为0.1 mL，第11列为生长对照，只含有0.1 mL RPMI-1640，不含抗真菌药物，第12列作阴性对照，均为0.2 mL的RPMI-1640。将纯化的菌种培养成熟后制备菌悬液，应用比浊仪结合血细胞计数板肉眼计数，RPMI-1640稀释，最终将丝状真菌调整菌悬液浓度至(1～5)×104CFU/mL，念珠菌调整至(1～5)×103CFU/mL。将制备好的菌悬液接种至药敏板上第1～11列，每孔均为0.1 mL。丝状真菌28℃、念珠菌35℃温箱静止孵育培养。丝状真菌96 h、念珠菌24 h开始观察结果，用肉眼观察结合酶标仪测OD值判定终点，与阳性对照孔比较，咪康唑、联苯苄唑、酮康唑、氟康唑和特比萘芬取80%的生长抑制作为终点判定，伊曲康唑取100%的生长抑制为终点判定。每株受试菌株均重复实验2次，结果平行。
2结果
2.1一般资料
102例临床怀疑甲真菌病患者中，真菌镜检阳性率61.8%(63/102)，培养阳性率80.4%(82/102)。真菌培养阳性患者中，男∶女=1∶1.73；患者发病年龄4～77岁，平均(46±15.3)岁；指甲∶趾甲=1∶1.1。50岁以上的老年人指甲感染更常见，指甲∶趾甲=2.25∶1(见表1)。
2.2菌种分布
共分离到82株真菌，其中皮肤癣菌60例(73.2%)，念珠菌属21例(25.6%)，非皮肤癣菌霉菌1例(1.2%)(见表2)。
2.3体外药敏试验
82株临床分离株对咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、联苯苄唑和特比萘芬的MIC浓度范围与几何均数情况(见表3)。皮肤癣菌对咪康唑、酮康唑、氟康唑、联苯苄唑和特比萘芬几何均数较低，提示敏感性较好，但是也有个别菌株在药物工作浓度范围内不敏感。根据M27-S4念珠菌的敏感性折点判定结果，80%以上的近平滑念珠菌对咪康唑、酮康唑、联苯苄唑和特比萘芬敏感，4株对氟康唑耐药，3株对伊曲康唑中度敏感；70%以上的白念珠菌对酮康唑和联苯苄唑的敏感；1株热带念珠菌除对联苯苄唑耐药外，对其他试验菌株都敏感。1株毛霉菌对所有实验药物均不敏感。
表1 82例甲真菌病患者年龄段和性别分布
表2甲真菌病患者82株分离株菌种分布
表3常见抗真菌药物对82株甲真菌病临床分离株的体外药敏结果(μg/mL)
3讨论
甲真菌病的发病率逐年增高，在老年人中更常见。我们研究发现50岁以上的老年人占调查人数的47.57%，与Dorko报道的一致。女性的发病率明显高于男性，尤其在40～49岁年龄段，男女构成比是1∶5.5，可能和女性更注重外表美观而就诊意愿高于男性有关。
我国各地综合的病原学调查中显示皮肤癣菌约占65%～70%，酵母菌约占10%～30%，主要分布在南方温暖潮湿地区。我们的研究结果显示皮肤癣菌占73.2%，念珠菌属占25.6%，与文献结果相符。
随着抗真菌药物在临床上的广泛应用，念珠菌感染的耐药也日趋升高，尤其是唑类抗真菌药物常是临床经验性治疗的首选药物。因此，对临床分离株进行菌种鉴定和体外药敏试验有助于临床医师了解念珠菌对抗真菌药物的敏感情况和选择用药。我们的药敏结果显示，绝大部分红色毛癣菌和须癣毛癣菌对临床常用的抗真菌药物的MIC值几何均数较低，提示敏感。氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬和联苯苄唑对须癣毛癣菌的MIC值范围与之前文献报道的结果几乎相同。我们分离到的酵母菌主要为白念珠菌和近平滑念珠菌，各为10株(12.2%)。10株白念珠菌中，各有5株对氟康唑和伊曲康唑耐药，与文献报道的氟康唑(54.1%)和伊曲康唑(53.4%)耐药情况一致，这可能与临床长期广泛使用氟康唑和伊曲康唑有关。白念珠菌和近平滑念珠菌对特比萘芬的敏感性分别为20%(2/10)和80%(8/10)，与文献报道的4.9%和87.5%相近。
药敏试验采用酶标仪与肉眼共同判读结果，具有较好的一致性。利用酶标仪读取结果可以提高灵敏度与精确度，使结果更加客观准确，减少主观视觉的误差，可行性高，可提高效率。治疗前了解致病真菌的菌种和体外药敏情况有助于临床医师参考用药。
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