鸡印第安纳株沙门菌生长、致病性及药物敏感性研究（一）
沙门菌属(Salmonella)隶属肠杆菌科(Enter⁃obacteriaceae)，拥有2 600多个血清型，是世界范围内造成人类和动物感染最频繁的人畜共患病原菌之一。禽类是沙门菌的天然宿主，其中危害鸡健康的主要血清型包括鸡白痢、鸡伤寒、肠炎、鼠伤寒、印第安纳等，沙门菌可同时通过水平和垂直方式在鸡群中进行传播。沙门菌不仅可以造成鸡的感染发病，给养鸡产业造成巨大的经济损失，还可以通过肉蛋产品传染给人类，持续地威胁食品和公共卫生安全。
目前，沙门菌在国内鸡群中的流行形势依然复杂严峻。Song等在国内9个省17个家禽养殖场调查发现，主要流行鸡白痢、肠炎和阿哥纳沙门菌，其中也分离到印第安纳沙门菌。对江苏某企业肉鸡产业链调查发现，印第安纳沙门菌和肠炎沙门菌为优势血清型，并且携带多种毒力岛基因。
针对广东、广西、福建和上海地区零售鸡肉源沙门菌血清型调查研究表明，肠炎、鼠伤寒、印第安纳、汤卜逊沙门菌较常见。本研究团队对安徽地区鸡源沙门菌流行特征的研究显示，安徽地区以肠炎、鼠伤寒和鸡白痢沙门菌为优势血清型，其中也分离到8株印第安纳沙门菌。
以上研究表明印第安纳血清型沙门菌是国内鸡群及其鸡肉加工和销售产业链中较常见的流行血清型。细菌耐药性的产生给家禽细菌性疫病的防治带来不利影响。研究发现，从鸡群中分离的沙门菌多重耐药性比例达到70%左右，其中对青霉素类、四环素类、氯霉素和磺胺类抗生素表现出较强的耐药性，而对氨基糖苷类和喹诺酮类的耐药性较弱。
安徽地区鸡源沙门菌显示出对青霉素类、四环素类和磺胺类抗生素的高耐药率，其中43.52%的菌株为多重耐药菌株并且具有复杂的抗生素耐药谱。
本研究从安徽省肥东县一养鸡场发病鸡病变组织中分离到1株印第安纳株沙门菌，对该分离株进行了生长、致病性、耐药性等相关特性的研究，并通过全基因组序列分析挖掘该菌株的毒力和耐药基因携带情况，以期为鸡场沙门菌病临床治疗提供指导，也为深入研究沙门菌致病和耐药的分子机制奠定基础。
1材料与方法
1.1病料
病料来自安徽省肥东县一土鸡养殖场，该养殖场为林地散养模式，发病鸡群为72日龄。将2只发病鸡送至安徽省农科院兽医临床指导中心进行剖检，发现其中1只病鸡肝脏呈现典型的古铜色病变，疑似存在沙门菌感染。
1.2主要材料
SPF鸡胚购自济南鑫盛达生物工程有限公司，由本研究室进行孵化和雏鸡饲养。缓冲蛋白胨水(PBW)、氯化镁孔雀绿增菌液(MM)和木糖赖氨酸培养基(XLT4)均购自青岛海博生物技术有限责任公司。2×PCR Premix、DL2000 DNA Marker、细菌基因组提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢曲松、恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、新霉素、大观霉素、庆大霉素、阿米卡星、多西环素、四环素、氯霉素、氟苯尼考、复方新诺明、甲氧苄啶、阿奇霉素、呋喃唑酮、亚胺培南、氨曲南和多黏菌素B共23种Kirby-Bauer药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司。
1.3细菌的分离鉴定
无菌采集2只病鸡肝脏样本作为细菌分离材料，接种到PBW进行预增菌培养，37℃培养12 h，而后转接到MM选择性增菌液中42℃培养16 h。在无菌条件下划线接种到XLT4培养基，37℃培养16 h。挑选中心呈黑色的疑似菌落接种到LB培养基中，37℃培养12 h。取菌液2 mL，12 000 r/min离心5 min，收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取细菌全基因组。利用16S rRNA基因通用引物进行PCR鉴定菌属，引物序列为27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC⁃·16AG-3′，1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系25μL:PCR Premix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水补至25μL。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32个循环;72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。
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