鸡印第安纳株沙门菌生长、致病性及药物敏感性研究（四）
3讨论
鸡的副伤寒是由除鸡白痢、鸡伤寒沙门菌之外的多种血清型沙门菌感染引起的鸡常见细菌病，病原包括肠炎、鼠伤寒、印第安纳等血清型沙门菌。副伤寒沙门菌中的绝大部分血清型也可导致人的感染，是对公共卫生安全具有重要意义的人畜共患病原菌。印第安纳沙门菌近年来在家禽养殖、屠宰加工和销售等动物性食品生产环节均有流行的报道。本研究从安徽一发病鸡病变组织中分离出1株疑似沙门菌，进一步通过选择性培养、16S rRNA测序和全基因组序列SeqSero 1.2数据库比对，确定为印第安纳沙门菌。Shen等在安徽鸡群中分离到多个血清型沙门菌，其中印第安纳沙门菌是鸡群中较为常见的流行血清型，并且该血清型沙门菌的污染可能随着家禽屠宰加工进一步向产业链延伸，已经成为我国畜禽产品生产中最常见血清型之一，威胁食品和公共卫生安全。
菌株致病性试验是评价其毒力的重要指标。Wang等对江苏分离的印第安纳、鼠伤寒和肠炎沙门菌进行了体内致病性试验，发现各个血清型沙门菌都可引起接毒小鼠的肝脏和肠道出现不同程度的临床症状和组织病变，其中印第安纳沙门菌的症状较轻，其LD50约为105 CFU/mL，致病性低于鼠伤寒和肠炎沙门菌。本研究采用SPF雏鸡攻毒试验评估分离株对鸡的致病性及其LD50发现，SM24分离株的LD50为8.50×105 CFU，接种雏鸡出现肝脏出血、胆囊充盈，脾脏略肿大、卵黄严重吸收不良等组织病变。研究发现，菌株毒力基因的携带与其致病性密切相关。通过全基因组测序和VFDB数据库比对发现，SM24携带280个毒力基因，其中主要为分泌系统、黏附、铁摄取、免疫逃避等相关毒力基因。
沙门菌T3SS是由SPI1和SPI2编码的蛋白质分泌系统，具有将效应蛋白直接注入宿主细胞的能力，可使细菌能够调节宿主细胞的多种反应，如细胞骨架重排、信号转导和细胞因子的产生，进而增加这些细菌的致病性。在SM24基因组中涉及分泌系统的基因主要编码T3SS，分别由35个SPI1基因和39个SPI2基因编码。除此之外，分离株基因组中还包含编码T6SS的基因，T6SS的存在能介导细菌与细菌之间以及细菌和宿主细胞之间的相互作用，使细菌在竞争中获得生存优势。
黏附因子是沙门菌重要的毒力因子，SM24菌株基因组拥有大量的菌毛黏附和运动侵袭黏附相关毒力基因。有研究发现，在体外黏附试验中，印第安纳沙门菌对细胞的黏附性和侵袭性明显低于鼠伤寒和肠炎沙门菌，但在黏附后的增殖效率显著高于其他血清型。铁摄取能力和免疫逃逸基因是细菌在宿主体内定殖、生长和逃避免疫的重要致病基础。
分离株可以编码多条与铁摄取和免疫逃逸相关的基因，此外，SM24基因组中还携带多种与入侵、调控、营养等相关的毒力基因。本研究表明，分离株SM24对SPF雏鸡具有明显致病性，并引发多种组织器官的病理变化，但关于其毒力基因与禽类宿主的致病性及其致病机制仍有待进一步研究。
耐药性表型检测发现，分离株SM24为多重耐药株，在测试的23种抗生素中对16种抗生素表现出耐药性，耐药谱广，临床上可选择用于治疗的药物很少，如不通过药敏试验筛选，极易造成治疗的失败。刘海霞等对广东省禽产品中印第安纳沙门菌的耐药情况调查发现，对四环素的耐药性达100%，对环丙沙星和头孢噻肟的耐药性分别为55.6%和30.6%，97.2%的菌株表现出多重耐药性。王鲁彦等对人源及动物源印第安纳沙门菌的耐药性研究发现，其对多种药物都呈现耐药性，且对阿米卡星、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、左氧氟沙星、吉米沙星的耐药率均逐年上升。Gong等发现印第安纳沙门菌分离株具有较高的耐药性，尤其是对四环素类、喹诺酮类、叶酸途径抑制剂、酚类、青霉素类、单内酰胺类和硝基呋喃类药物。菌株耐药基因的携带率与菌株的耐药表型呈现出显著的相关性。
通过对SM24基因组序列比对，发现该分离株共携带144个与耐药相关的编码基因，其中大部分与多重耐药性相关。与本研究的发现类似，很多研究报道显示印第安纳沙门菌基因组中携带大量耐药基因。Yu等在家禽分离的印第安纳沙门菌中鉴定出65个属于不同家族的抗性基因，包括编码与抗生素外排泵、降低β-内酰胺渗透性、对克林霉素产生抗性的突变体、耐磺胺类和耐三甲氧苄啶等相关耐药基因。
王学锋发现多数印第安纳沙门菌分离株携带blaCTX-M(blaOXA-1、blaTEM-1)、sul1、aacC4、aac(6′)-Ib、floR和dfrA17耐药基因。一些研究发现，在从鸡或鸡肉产品中分离的印第安纳沙门菌的基因组中出现mcr-1基因，在本研究和已报道的安徽地区鸡源印第安纳沙门菌基因组中尚未发现mcr-1基因的携带。由于mcr-1基因编码的耐黏菌素基因可导致“超级细菌”的出现，因此应持续关注mcr-1基因在沙门菌中的分子流行动态。
研究表明，印第安纳沙门菌的多重耐药性与细菌染色体上的1类整合子和IncHI2质粒携带的多种抗生素耐药基因密切相关。本研究中SM24分离株基因组中未发现1类整合子基因，但在其基因组中存在1个IME位点并携带OmpK37耐药基因。SM24基因组中携带的质粒类型为IncHI2质粒，包含IncHI2和IncHI2A两个复制子，并且携带11种不同的耐药基因，由此推断，该印第安纳沙门菌分离株具有整合和水平转移耐药基因的能力。细菌为应对外界环境的变化，在遗传进化过程中会形成独有的基因组特征。
分离株与6株国内鸡源印第安纳沙门菌分离株基因组的比较分析表明，除共有基因外，分离株SM24拥有最多的独有基因。通过构建的细菌基因组进化树发现，分离株SM24与国内6株印第安纳沙门菌的遗传距离均较远，表明其可能具有较为独特的生理和代谢特征，可为进一步研究相关独有基因功能提供基础素材。
4结论
从安徽肥东地区发病鸡病变组织中分离出1株印第安纳沙门菌，该分离株对雏鸡具有致病性，对16种抗生素表现出明显耐药性，耐药谱广。进一步全基因测序分析，发现其基因组携带大量毒力和耐药相关基因，且具有可转移耐药基因的IME位点和IncHI2质粒。本研究为深入探讨印第安纳沙门菌致病和耐药的分子机制提供参考。
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