浒苔多糖降解微生物采集、分离、筛选、鉴定及生长曲线测定（二）
1.2浒苔多糖的提取
采取已建立的热水浴加乙醇沉降的方法提取浒苔多糖，具体步骤为：将浒苔清洗干净后，取适量于无菌水中，置于90℃水浴锅水浴7 h，收集液体，重复操作2次。将所得液体离心（4 800g（g为重力加速度），15 min）去杂质后浓缩至50 mL。加1/5提取液体积的氯仿正丁醇溶液（氯仿∶正丁醇=5∶1）剧烈震荡30 min后离心，取水相，去除提取液中的蛋白质，重复3次至无白色沉淀，收集上清液。将收集的液体用3倍体积的无水乙醇沉降，离心去上清，待干燥后加入适量无菌双蒸水溶解备用。
1.3浒苔多糖降解微生物的筛选
将提取的浒苔多糖以5 g/L的终浓度加入无碳的海洋无机盐培养基（minimum marine medium，MMM）中，该培养基含有25.95 g NaCl，2 g MgCl2·6H2O，3 g MgSO4·7H2O，0.12 g CaCl2·2H2O，27 mL 0.5 mol/L Na2EDTA，25 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH=8），10 mL 1 mol/L NH4Cl，0.8 g K2HPO4，0.2 g KH2PO4，0.015 g FeSO4·7H2O，0.03 g H4MoNa2O6，1 mL微量元素混合液（含H3BO3 2.86 g/L，MnCl2·4H2O 1.86 g/L，Zn SO4·7H2 O 0.22 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.39 g/L，CuSO4·5H2O 0.08 g/L，Co（NO3）2·6H2O 0.05 g/L）和1 mL 1 000*维生素混合物。将分离到的菌株接种到以浒苔多糖为唯一碳源的MMM液体培养基中，28℃、200 r/min震荡培养，根据生长情况判断各菌株对浒苔多糖的利用能力，筛选出能利用浒苔多糖的菌株。同时，按照BIOLOG使用方法，用PM2A碳源利用板测试几株菌对PM2A板上各碳源的利用情况。
1.4浒苔多糖降解菌的生长曲线测定
为了测试筛选出的浒苔多糖降解菌株A1-6和S7对浒苔多糖的利用能力及对其他碳源的利用情况，用2216E液体培养基加上浒苔多糖及其他碳源测试菌株的生长曲线及碳源利用谱。除浒苔多糖外，测试的碳源有：葡萄糖、α-乳糖、D-果糖、D-麦芽糖、D-半乳糖、蔗糖、木聚糖、糊精、可溶性淀粉及明胶。配制以上各种糖的储备液，质量浓度为20 g/L。所用糖溶液经121℃、15 min高温蒸汽灭菌后使用。取保存的A1-6和S7菌种，用2216E液体培养基培养，转接3代活化。取15 mL无菌培养管，每管加入2216E培养基9 mL，待测糖储备液1 mL（终质量浓度为2 g/L），接种菌液1 mL。以不加糖储备液的培养物作为对照。每组培养物各重复做3次。用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统扫描计算培养物在600 nm下的OD值。
2结果分析
2.1采样点浒苔绿潮的情况
2020年2月广西北海爆发了浒苔绿潮。图1（a）为广西北海金海湾海域的绿藻，发现引发此次绿潮的绿藻主要有2种：丝状的浒苔及片状的浒苔。2021年7月，山东青岛爆发了浒苔绿潮，图1（b）为山东青岛栈桥海域的绿藻，引发此次绿潮的绿藻主要为丝状浒苔。
2.2北海及青岛样品分菌结果分析
北海样品分离的微生物鉴定结果见表1。北海样品中共分离到13种菌，其中海水样品中有8种，丝状浒苔附着菌分离到7种，片状浒苔附着菌分离到4种（3个样品中分离到的菌株存在部分重复，如交替单胞菌Alteromonas macleodii和Alteromonas oceani在3个样品中都分离到；Polaribacter marinaquae和Maribacter dokdonensis分别在2个样品中都有分离到）。共分离到3种黄杆菌：Polaribacter marinaquae、Maribacter dokdonensis、Cellulophaga lytica。其中，在海水及片状浒苔上有分离到Polaribacter marinaquae（片状浒苔上4次都分離到），丝状浒苔上没有分离到Polaribacter marinaquae；在片状浒苔上和丝状浒苔上都有分离到Maribacter dokdonensis（丝状浒苔上2次分离到），海水中没有分离到Maribacter dokdonensis；只在丝状浒苔上分离到1株Cellulophaga lytica。
青岛样品分离的微生物鉴定结果见表2。青岛样品中共分离到22种菌，其中海水样品中有10种，丝状浒苔附着菌分离到12种，共分离到4种黄杆菌：Meridianimaribacter flavus、Tenacibaculum geojense、Tenacibaculum mesophilum和Algibacter lectus，4株都是在丝状浒苔上分离到的，海水中没有分离到。对比2个采样点的分菌结果，只有Alteromonas confluentis在北海和青岛样品中都有分离到。其他菌株均不相同，包括2个样点分离到的黄杆菌也不相同。
在菌株鉴定的基础上，对重点分析的5株菌：菌株A1-6、S7、A2-2、aA1-7和aA1-9构建了基于16S rRNA基因序列的系统发育树（见图2）。从图2可见，菌株A1-6与Alteromonas confluentis亲缘关系最近，聚成一支，且属于γ变形菌（γ-proteobacteria）。菌株S7、aA1-7、aA1-9、A2-2分别与Algibacter lectus、Cellulophaga lytica、Maribacter dokdonensis和Polaribacter marinaquae聚成一支，都隶属于黄杆菌（Flavobateria）。
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