GR基因缺失对溶藻弧菌生物学特性及抗生素敏感性的影响（一）
摘要：
【目的】研究敲除谷胱甘肽还原酶（GR）基因gr对溶藻弧菌HY9901生物学特性的影响。
【方法】通过同源重组技术和Overlap PCR等分子生物学手段构建溶藻弧菌HY9901的gr基因缺失株，通过反转录验证并检测其遗传稳定性，绘制该菌的野生株和缺失株的生长曲线，测定该菌野生株和缺失株的生物膜形成能力、抗生素敏感性、胞外蛋白酶活性和泳动能力等生物学特性。
【结果】gr基因的缺失几乎不影响溶藻弧菌的生长趋势，但敲除gr基因后溶藻弧菌对呋喃唑酮、头孢唑林、四环素等敏感性增强，该菌的生物膜形成能力显著提高。缺失株△gr的胞外蛋白酶活性和泳动能力均低于野生株。
【结论】谷胱甘肽还原酶在溶藻弧菌的毒力、生物膜形成、药物敏感性、泳动等方面有重要作用。
溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）隶属于弧菌科（Vibrionaceae）弧菌属（Vibrio），为嗜盐嗜温性、兼性厌氧的革兰阴性菌，广泛分布于海洋环境和海洋生物中，可感染鱼、虾、贝等海水养殖动物。近年来，随着养殖环境的不断恶化，由溶藻弧菌引起的暴发性弧菌病呈不断上升趋势，给海水养殖业造成重大的经济损失。
在生物系统中，干旱、低温、高温、盐胁迫、抗生素、重金属和紫外辐射等各种环境胁迫可诱发活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的过量产生，对细胞造成严重损伤。生物细胞内的重要氧化剂谷胱甘肽（GSH），可有效抵抗ROS对细胞的伤害，维持细胞内较稳定的氧化还原平衡状态。谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase,GR）是谷胱甘肽抗氧化系统中主要抗氧化酶之一，广泛分布于原核生物和真核生物中。在还原型辅酶NADPH作用下，GR催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）转化为还原型谷胱甘肽，为有效清除细菌细胞内ROS提供还原力，从而保护细胞免受伤害，是在氧化应激期间维持细胞氧化还原状态的关键酶。因此，GR在氧化应激、冷应激、盐胁迫和金属离子耐受性等应激反应中有重要作用。吕洁婷等研究发现，单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）gr基因缺失后，其运动能力、感染宿主能力及抗氧化应激等增强。庞欢瑛等将与GR同属于黄素蛋白氧化还原酶家族的二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLDH）的dldh基因敲除后，溶藻弧菌的泳动能力、生物膜形成能力、生长和胞外蛋白酶活性等均减弱。有关溶藻弧菌gr基因缺失株的生物学特性未见报道。本研究通过同源重组技术和Overlap PCR等分子生物学手段构建溶藻弧菌gr基因缺失株，比较其与野生株HY9901的生物学差异，为防治溶藻弧菌病提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株溶藻弧菌HY9901（V.alginolyticus）、大肠杆菌DH5α（Escherichia coli DH5α）、大肠杆菌β2163（E.coliβ2163）均保存于广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室（下称“本实验室”）。
1.1.2质粒自杀质粒pLP12（含氯霉素Cm）取自本实验室。
1.1.3主要试剂和引物LB液体培养基，酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L及NaCl 30 g/L；LB固体培养基，酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 30 g/L及琼脂粉15 g/L；氯霉素（Cm），生工生物工程（上海）股份有限公司；切胶回收纯化和质粒提取试剂盒，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；细菌总DNA提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司；pMD-18T克隆载体，Takara公司；微生物生长动态监测系统，丹麦Biosense公司；PrimerSTAR Max，Takara公司；引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表1溶藻弧菌gr基因的缺失株构建的引物
1.2方法
1.2.1缺失株△gr的构建以gr-MF1/gr-MR1扩增得GR上游同源臂A片段612 bp；以gr-MF2/gr-MR2扩增得GR下游同源臂B片段577 bp，纯化A、B片段，经Overlap PCR扩增后，获得1 189 bp融合AB片段。将纯化的AB片段与自杀质粒pLP12（Cm+）连接，得重组质粒，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于LB平板（含Cm 20μg/mL，D-葡萄糖3 g/L）。用pLP-UF/pLP-UR筛选AB插入的重组克隆，阳性克隆经纯化、扩大培养后，提取质粒pLP12(Cm+)-gr，转化至大肠杆菌β2163，培养3 h，涂布于LB平板（含Cm 20μg/mL，二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid,DAP)0.3 mmol/L，D-葡萄糖3 g/L），挑取阳性克隆，划线纯化培养。
分别将大肠杆菌β2163[pLP12（Cm+）-gr]与溶藻弧菌培养24 h，分别取400μL供体菌和800μL受体菌，混匀，离心，去上清，以LB培养基重悬，重复1次，滴入LB平板(含DAP 0.3 mmol/L，D-葡萄糖3 g/L)，于37℃下倒置培养6 h。以1 mL LB重悬，稀释后取100μL涂布于LB平板（含Cm 20μg/mL，D-葡萄糖3 g/L），挑取单克隆，液体培养，以gr-TF/PLP-UTR对克隆进行检测。挑取阳性克隆，稀释，涂布于LB平板（含L-阿拉伯糖4 g/L），于30℃下培养24 h，挑取平板上的克隆，以引物gr-TF/gr-TR进行检测，并递交PCR产物测序验证，获得△gr缺失株，稳定遗传30代后，置于-80℃下保存。以上实验步骤根据表1设计的对应引物进行菌落PCR鉴定并测序，反应体系：DNA模板1μL，PrimerSTAR Max 10μL，上下游引物各1μL，ddH₂O 7μL。扩增程序：98℃3 min；98℃10 s，X℃20 s，72℃Y s，72℃7 min，30个循环。
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