携带抗生素耐药基因沙门菌P1噬菌体-质粒效价、形态、一步生长曲线及最适温度（三）
2.5 P1-CTX噬菌体-质粒最适温度和pH稳定性
P1噬菌体头部由蛋白衣壳及双链DNA组成，蛋白质在温度较高或者强酸强碱条件下易产生变性，因此，噬菌体活性往往易受其影响。由于噬菌体衣壳由不同结构蛋白组成，其在不同温度和酸碱度条件下，活性表现出差异。由图4可知，P1-CTX噬菌体-质粒在温度高于50℃时，噬菌体活力开始显著下降(P<0.05)，且随着时间延长，效价下降明显。当温度高于60℃时，孵育30 min，噬菌体效价降为初始的十分之一。80℃时，噬菌体失去活力。当温度在30℃~50℃之间30 min内对噬菌体活性影响较小，其效价并没有显著变化。而伴随时间的延长，噬菌体活力慢慢降低，因此P1-CTX噬菌体-质粒的最适温度为30℃~50℃。
图4 P1-CTX噬菌体-质粒不同温度噬菌体活性
不同酸碱条件下噬菌体的效价如图5，噬菌体最佳pH为7，在pH 4~7和7~12噬菌体效价有所降低，但并不明显。而当pH为2时，噬菌体效价显著降低。所有不同pH情况下，随着噬菌体孵育时间长达120 min时，噬菌体活力均有所降低。
图5 P1-CTX噬菌体-质粒不同pH噬菌体活性
2.6 P1-CTX噬菌体-质粒适应性及稳定性测定
为检测P1-CTX噬菌体质粒对转导宿主的影响，试验随机挑选P1-CTX噬菌体-质粒转导成功的大肠埃希菌和沙门菌各2株，检测了P1噬菌体-质粒成功转导后的宿主37℃12 h的生长情况。结果如图6所示，P1-CTX噬菌体-质粒转导前，对无论是沙门菌(BYC4和A85)还是大肠埃希菌(RC15和HJM51)宿主的生长情况影响不明显。
图6 P1-CTX噬菌体-质粒在不同宿主中的生长曲线
稳定性试验结果如图7所示，所选P1-CTX噬菌体-质粒转导成功的大肠埃希菌和沙门菌各2株30 d传代培养，P1-CTX噬菌体-质粒在转导宿主菌中100%稳定。
图7 P1-CTX噬菌体-质粒在不同受体宿主菌中稳定性
3讨论
沙门菌是最为常见的人畜共患病原菌和食源性致病菌之一，世界范围内每年大约有9 380万例沙门菌感染事件，导致15.5万感染者死亡。沙门菌主要通过被污染的肉类和禽蛋传递给人，引发败血症、腹泻、肺炎、尿路感染等多种疾病。第三代头孢菌素(third generation cephalosporins，3 GCs)被广泛应用于人医和兽医领域沙门菌感染疾病的临床治疗中，而耐3 GCs沙门菌的出现对其引起感染的疾病的防治提出了新的挑战。blaCTX-M-27亚型基因是介导细菌对3 GCs耐药的主要基因之一，在全球动物和人中均被广泛检出，往往造成严重的医院和社区感染，对人类健康和公共卫生构成了重大威胁。有研究者认为，质粒是介导细菌间超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)广泛传播最常见和最重要的因素，而由噬菌体介导的耐药基因水平传播，现在被认为要频繁得多，其在细菌耐药发展中具有重要作用，但往往也最容易被忽视。近年来，在细菌中频繁检出携带耐药基因的噬菌体，使得噬菌体传播耐药性这一问题引起人们的重视。因此，研究携带耐药基因的溶源噬菌体的生物学特性可以全面评价噬菌体在耐药基因传播中的潜在风险。
本研究中P1-CTX噬菌体-质粒与其他烈性噬菌体和报道的大肠埃希菌中P1噬菌体不同，其效价偏低，其最高可达106 PFU·mL-1，且丝裂霉素诱导不同条件下均不能完全使噬菌体释放出来。温度为37℃和42℃下能在短时间内诱导，而温度在26℃和32℃需要延长诱导时间。一步生长曲线是查看噬菌体的生命周期及爆发量的最直观手段，P1-CTX噬菌体-质粒在与受体宿主接触50 min时开始释放噬菌体粒子，到100 min时达到平台期，每一个噬菌体可释放出63个子代噬菌体。而大肠埃希菌中无抗生素耐药基因携带的P1噬菌体，感染宿主60~70 min开始释放噬菌体子代颗粒，其最高爆发量可达100至200 PFU·cell-1。研究表明，噬菌体的生命周期以及噬菌体粒子的产生会受到某些随机事件的影响，如本研究中P1-CTX噬菌体-质粒与P1噬菌体爆发量的差异，可以推测P1-CTX噬菌体-质粒的裂解和释放等特征主要受到噬菌体基因组大小和宿主等因素影响。
感染复数影响噬菌体在其宿主菌中的增值，研究表明，高感染复数可诱导宿主菌的细胞裂解，阻断噬菌体的正常增值。噬菌体最佳感染复数通常作为噬菌体生物学特性的指标之一被广泛研究，其可以更好的表征噬菌体和宿主菌间作用的最佳浓度比和绝对数量。噬菌体相关研究过程中，通常需要得到高效价的噬菌体悬液，所以研究噬菌体与宿主菌间的比例，有利于制备高效价的噬菌体悬液。本试验P1-CTX噬菌体-质粒的最佳MOI为0.01。本试验同时也检测了P1-CTX噬菌体-质粒在不同环境条件(温度和pH)下的稳定性，发现50℃以下P1-CTX活性影响较小，表明在正常的自然环境温度下P1-CTX可稳定持续存活。本研究还测定了pH对P1-CTX噬菌体-质粒的影响，发现P1-CTX在pH为4~12时，其活力较好，且P1-CTX耐强碱而不耐强酸。综上可知，相较于其他噬菌体，P1-CTX在环境中稳定性较强，存在较大传播耐药基因blaCTX-M-27的风险。
由于噬菌体转导后与宿主的相互作用，可改变宿主生长状况，包括宿主菌抗生素敏感性、多药外排泵、适应性、生物膜形成、定植入侵以及脂多糖和外膜蛋白等。本研究中的P1-CTX噬菌体-质粒在细菌中对宿主细菌生长不产生任何代偿影响，且30 d的持续培养噬菌体稳定高达100%。这表明P1-CTX噬菌体-质粒不仅对宿主没有产生任何适应性代价，并且其携带的blaCTX-M-27耐药基因可以促进宿主细菌在抗生素压力下持续存在。应当引起重视是，近期在鸡肉沙门菌中也发现了该P1-CTX噬菌体-质粒，说明P1-CTX噬菌体-质粒具有传播耐药的能力。因此，P1-CTX噬菌体-质粒作为一种新的相对广泛的宿主谱P1噬菌体，可能在blaCTX-M-27耐药基因在细菌间扩散起着重要作用。
4结论
本研究通过丝裂霉素C成功诱导出携带耐药基因blaCTX-M-27的P1-CTX噬菌体-质粒，其效价为106 PFU·mL-1，耐强碱而不耐强酸，且其对转导成功的大肠埃希菌和沙门菌宿主生长无影响并可持续稳定存在。
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