五种常用抗真菌药物对198株白色念珠菌最低抑菌浓度【药敏试验】
白色念珠菌(Candida albicans，CA)是最常见的一种条件致病性真菌，大多发生在机体免疫力低下或菌群失调时，如肿瘤、慢性消耗性疾病、长期大量使用广谱抗生素、免疫抑制剂和激素等过程中易发生感染白色念珠菌，深部白色念珠菌感染的病死率高达68.90%。用常规培养的方法繁琐且费时，漏检率也很高。因此，快速、准确地从临床标本中直接检出白色念珠菌对于疾病的早期诊断和治疗以及对该病的流行病学调查亦有十分重要的意义。我们从2005年到2008年在临床病例中分离了198株白色念珠菌，采用聚合酶链反应(nested PCR，nPCR)从临床标本中直接检测白色念珠菌，取得了良好的效果。目前，白色念珠菌对临床上常用的几种抗真菌药物的耐药率已达到相当高的比例，这给临床上抗真菌感染治疗带来一定困难。为了解白色念珠菌对抗真菌药物的敏感性，以便为临床正确选择抗真菌药物和有效控制白色念珠菌引起的感染提供依据，我们测定了五种常用抗真菌药物对198株白色念珠菌最低抑菌浓度(MIC)，现报告如下。
1材料与方法
1.1临床分离菌株来源白色念珠菌标准菌株CA16为本实验室保存，临床分离菌株共339份，包括痰液109份，尿液85份，阴道拭子78份，咽拭子20份，创面分泌物19份，腹水8份，胸水6份，血液9份，脑脊液5份。以上标本均来自长春中医药大学附属医院。
1.2模板液制备挑取纯菌落混匀后置于55℃1 h，煮沸5 min，取出后1000 rpm离心30 s，上清即为扩增的模板液。临床标本处理:尿液、脑脊液、胸水、腹水等液体标本可直接取1ml备用，抗凝的血液直接吸取1 ml备用，拭子类标本应先置拭子于1-2 ml生理盐水中充分洗脱后，吸取1 ml备用。
1.3引物设计白色念珠菌种特异性引物系从内转录2区(internaltranscribedspacer-2，ITS-2)中选择，CAF:5'-AACTTGCTTTGGCGGTGGGG-3';CAR:5'-TGGACGTTACCGCCGCAAGCC-3'，目标碱基长度为386 bp，引物由大连宝生物合成。
1.4 PCR检测
用引物CAF和CAR，以各菌株为模板，反应体系为:10×ExTaq Buffer，2.5μl;dNTP(10 mM)，0.5μl;CAF/CAR，各0.5μl;ExTaq酶，0.25μl;Template，1μl;ddH2O，19.75μl;总体积，25μl。反应条件为:94℃预变性4 min，然后进入循环，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min，1%琼脂糖凝胶电泳。
1.5测OD值、活菌计数
在超净工作台内用接种环挑取单菌落接种于5ml改良沙堡氏液体培养基的试管中，置30℃恒温摇床振荡培养过夜。将培养过夜的菌液用血细胞计数板计数并用灭菌改良沙堡氏液体培养基调整菌液浓度为5×104CUF/ml。
用移液器分别吸取上述10μl接种菌液加入300 ml改良沙堡氏液体培养基的三角烧瓶中，置30℃恒温摇床振荡培养，从培养0 h时起及以后，每隔2 h取菌测OD530值。
1.6药敏试验
取150μl菌液加入药敏培养基，混匀后取150μl加入药敏试验孔，30℃湿盒培养20 h-24 h后加显色剂，继续培养12 h-24 h后读取药敏结果。
2结果
2.1临床标本白色念珠菌PCR检测
339份临床标本包括痰、尿、咽拭子、血液等，PCR检出结果显示从痰标本中分离出的白色念珠菌最多77株占70.2%，其次是阴道拭子53株占67.4%，具体分布情况见表1，部分标本的PCR电泳图见图1，扩增出目的片段大小386 bp，与预期片段大小一致，其中5号泳带为阳性对照，6号泳带为阴性对照，其他3份标本均为白色念珠菌。
表1临床标本白色念珠菌PCR检测结果
2.2白色念珠菌生长速率实验
在培养条件不变的情况下，每2 h取样测定其在530 nm处的OD值，然后以时间为横坐标，OD的对数为纵坐标可形成一条生长曲线。白色念珠菌生长的迟缓期为0-16 h，对数生长期为16-30 h，之后进入稳定期和衰退期。生长曲线如图2:
图1 PCR电泳图
2.3白色念珠菌药敏试验
对198株白色念珠菌进行药物敏感试验，药物敏感性由高到低为:氟胞嘧啶(92%)、两性霉素(87.9%)、制霉素(85.4%)、酮康唑(29.8%)、咪康唑(18.7%)、伊曲康唑(14.1%)、氟康唑(5%);耐药性由低到高为:氟胞嘧啶(2.5%)、制霉素(5%)、两性霉素(8%)、酮康唑(8.6%)、咪康唑(39.9%)、伊曲康唑(45%)、氟康唑(75.8%)，见表2。
图2白色念珠菌生长曲线
表2 198株白色念珠菌药敏表
3讨论
白色念珠菌是引起临床上深部真菌感染常见的病原菌，80%以上AIDS患者受真菌尤其是白念珠菌感染比较常见，深部真菌感染已成为许多疾病的主要死亡原因之一。所以从基因水平上检测白色念珠菌是近年研究的热门，基因检测方法具有快速、高特异性、高敏感性等优点，相信基因检测技术一定能广泛用于临床。
本实验中我们用PCR技术对临床标本339份白色念珠菌进行检测，检出白色念珠菌198株，检出率为54%。检出率高的原因是由于这些患者年老、体弱、病重、抗生素大量使用，使机体免疫力下降，导致体内微生态平衡紊乱，从而使条件致病性真菌特别是白色念珠菌大量繁殖。有学者认为抗生素是直接促进真菌生长和毒性作用发挥的主要因子。抗生素的不合理应用是促使真菌生长的重要因素，因此合理应用抗生素十分关键。从统计结果可以看出，白色念珠菌感染多见于呼吸道和泌尿道，它在痰标本检出率最高，检出率为70.2%;其次是尿液标本，检出率为67.4%。白色念珠菌作为正常菌群的一部分，在人的呼吸道和肠道少量存在，当人的免疫防疫系统由于疾病或呼吸机、气管插管、留置导尿管等医源性因素而损害，引起继发性感染，从而引起痰检率或尿检率白色念珠菌的升高。
细菌的生长指细菌有规律的增长，包括细菌体积的增大，代谢功能的完善及细菌数量的增多。不同的菌种有其各自不同生长规律。本实验显示白色念珠菌生长的迟缓期为0-16h，对数生长期为16-30 h，之后进入稳定期和衰退期，因此在对白色念珠菌进行研究时，我们一般选取培养24-28 h的培养物进行研究。
白色念珠菌在女性阴道中的发病率较高，随着抗生素、免疫抑制剂及各种激素的广泛使用，各种细菌的耐药性逐年升高，而真菌的药敏情况亦如此。为了给临床提供治疗白色念珠菌的有效途径，我们对2008年我院分离的198株白色念珠菌进行药敏分析，结果显示:氟胞嘧啶、两性霉素、制霉素的敏感率较高，与有关文献报道大多耐药性一致，而敏感性有差异，这可能跟不同地区的用药习惯有关。酮康唑、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑作为广谱抗真菌药，应用广泛，导致中度敏感和耐药性增高。因此，临床在治疗白色念珠菌时，特别反复感染白色念珠菌者，应做药敏试验，避免药物滥用，以达到最佳的治疗效果。
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