驴源马链球菌马亚种LXY019株的分离鉴定、生长曲线、致病性及耐药性分析（一）
摘要
为探究新疆喀什某驴场驴腺疫病的病原菌及其相关生物学特性，应用绵羊鲜血培养基对采集样品进行细菌的分离纯化，通过革兰氏染色、镜检及PCR扩增对分离菌进行鉴定，并利用MEGA7.0生物软件绘制分离菌的遗传进化树；绘制分离菌生长曲线，通过分离菌体内致病性试验、毒力基因检测试验以及药物敏感性试验等对分离菌进行生物学特性分析。结果显示，获得一株具有β溶血特性且革兰氏染色阳性的链球菌，测序结果通过GenBank的Blast比对，与已注册马链球菌马亚种同源性高达99.01%，遗传进化树分析发现该分离菌与新疆马链球菌马亚种HTP133(MT815602.1)遗传距离最近，命名为LXY019株；从生长曲线可以看出该分离菌在培养8h后达到平台期，18h后走向衰亡；致病性试验结果显示，分离菌对小鼠的LD50为1.58X10⁷CFU/mL，毒力基因鉴定结果提示该分离菌携带fneB和seM；药敏试验结果显示该分离菌对β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素高度敏感，对氨基苷类抗生素的敏感性相对较低。以上结果表明，分离纯化的驴源马链球菌马亚种对小鼠具有明显的致病性，临床治疗可优先选用β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素，结果可以为驴源马链球菌马亚种感染引起的驴腺疫的防治提供参考。
马链球菌马亚种(Streptococcus equi subspecies equi, S. equi)是引起腺疫的主要病原菌，可导致马属动物体温升高、呼吸道炎症并分泌黏性及脓性分泌物、下颌淋巴结肿胀等，马链球菌马亚种对外界环境抵抗力较强，最早被鉴定于1888年。2018年山东省的6个养驴场爆发了腺疫，中国首次分离获得驴源马链球菌马亚种，研究发现，1岁以下驴的发病率(40.3%)和死亡率显著高于成年驴。同年，新疆和田市某驴场从山东等地区引进的8000多头肉驴感染腺疫。除此之外，河南、河北、辽宁、山西、陕西、内蒙、甘肃等多个地区先后爆发驴腺疫。目前，该病已成为危害中国马属动物养殖业的主要细菌性传染病，给养殖业造成了较大的经济损失。
马链球菌马亚种的天然宿主为马属动物，马腺疫的报道比较频繁，但近些年关于马链球菌马亚种感染驴的报道逐渐增多。因此，通过对驴腺疫分离菌进行遗传进化分析，有利于追溯该驴场感染腺疫的传播途径，进行分离菌致病性及毒力基因携带情况分析，可评估驴源马链球菌马亚种的危害性，药物敏感性检测可为有效防控该病原菌引起的疾病提供参考。因此，对从新疆喀什泽普县驴场分离鉴定获得的一株马链球菌马亚种进行致病性、毒力基因及药物敏感性进行研究，旨在阐明驴源马链球菌马亚种的危害性，寻找抵抗该病原菌的有效防控措施。
1 材料与方法
1.1 病料来源
新疆喀什泽普县某驴场的驴群出现精神沉郁，饮食欲减退，结膜潮红，流黄白色脓性鼻液，下颌淋巴结稍微肿大，体温升高，粪便干燥、排便减少，尿少而黄等症状，采集患病驴鼻拭子48份，4℃条件下送至新疆农业大学动物医学学院中兽医学实验室。
1.2 试验动物及供试菌株
25只SPF级KM小鼠，体质量(20±2)g，6周龄，购自新疆医科大学实验动物中心。马源马链球菌马亚种(SEE-M)和马链球菌马亚种标准菌ATCC9528均保存于新疆农业大学动物医学学院中兽医学实验室。
1.3 主要试剂
脱纤维绵羊鲜血、革兰氏染色试剂盒、TE缓冲液均购自北京索莱宝科技有限公司；2×Es Taq Master Mix (Dye)购自北京全式金生物技术有限公司；引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；药敏纸片购自杭州滨和生物公司；琼脂粉、THB培养基均购自青岛海博生物科技有限公司。
1.4 疑似菌的分离及镜检
将3mL生理盐水加入每份鼻拭子收集管后室温震荡混匀，取400μL混合液加入THB液体培养基(1:10)中，37℃、180 r/min振荡培养18~24h，即得受试菌液；接种环蘸取受试菌液，划线接种于50mL/L绵羊鲜血固体培养基上，37℃、倒置培养18h，挑取β溶血的单菌落继续重复上述操作3次，进行细菌纯化，至鲜血培养基上的菌落形态单一、稳定，挑取鲜血平板上针尖大小、β溶血的单菌落于载玻片上，经革兰氏染色后于油镜下观察。
1.5 分离菌的16S rDNA序列测定及分析
挑取一个在50mL/L绵羊鲜血培养基上纯化完成的单菌落于20μL TE buffer中，吹打混匀，PCR仪95℃5 min，得到菌体DNA作为模板，进行PCR扩增(正向引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反应条件：94℃ 10 min；94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s，共35个循环；72℃延伸10 min。反应结束，用凝胶成像分析系统观察结果。若出现1466bp目标片段，将PCR反应产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果于NCBI的BLAST进行比对，确定是否为马链球菌马亚种。
1.6 分离菌的生长曲线绘制
将活化好的驴源分离菌（LXY019）、马源菌（SEE-M）及标准菌（ATCC9528）分别接种于新鲜THB液体培养基中，使用生理盐水调整初始菌液浓度至1×10⁶ CFU/mL。取200μL稀释菌液加入丹麦Biosense微生物生长动态监测系统专用的无菌一次性检测板孔中，每种菌设3个重复孔，并设置只含THB培养基的孔作为空白对照。将检测板置于Biosense系统的恒温培养模块中，设置温度为37℃。系统通过内置的光学检测单元，对每个孔在600 nm波长处的吸光度（OD₆₀₀）进行连续、实时的非侵入式监测，测量间隔设置为10分钟，持续监测24小时。系统自动记录并绘制光密度随时间变化的生长曲线。实验结束后，利用系统配套软件导出数据，以时间为横轴、OD₆₀₀平均值为纵轴，分别绘制三株菌的生长曲线图，并分析其生长特性。
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