忍冬提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌生长曲线、细胞形态和生物膜形成能力的影响（二）
1.2实验方法
1.2.1忍冬不同部位总酚、总黄酮和绿原酸含量测定
1.2.1.1忍冬不同部位总酚、总黄酮和绿原酸的提取
将金银花、忍冬叶和忍冬藤60℃热风干燥至恒重，粉碎后过50目筛，备用。称取1 g样品，加入15 mL 60%乙醇，60℃、200 W超声水浴提取30 min。在4℃下10000 r/min离心10 min，收集上清液，过0.22μm滤膜，于4℃冰箱保存。
1.2.1.2总酚含量的测定
采用Folin-Ciocalteu法，将1 mL样品与5 mL Folin-Ciocalteu混合，反应5 min，加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液，避光反应60 min，在765 nm下测定。根据没食子酸标准曲线的线性回归方程（y=0.0067x−0.0781，R2=0.9979）计算总酚含量，结果以每g样品的没食子酸当量mg表示（mg GAE/g）。
1.2.1.3总黄酮含量的测定
采用AlCl3比色法，将1 mL样品与0.5 mL 5%NaNO2溶液混合，反应5 min，加入1 mL 5%AlCl3溶液反应5 min，加入2 mL 8%NaOH溶液反应10 min，在510 nm下测定。根据芦丁标准曲线的线性回归方程（y=0.0026x−0.0399，R2=0.9991）计算总黄酮含量，结果以每g样品的芦丁当量mg表示（mg RE/g）。
1.2.1.4绿原酸含量的测定
采用高效液相色谱法，色谱柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；色谱条件：温度30℃；检测波长320 nm；进样体积20μL；体积流量0.6 mL/min；流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脱条件为0~10 min，5%~30%A；10~25 min，30%~50%A；25~35 min，50%~70%A；35~40 min，70%~5%A。以绿原酸浓度（mg/mL）为横坐标（x），色谱峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。根据绿原酸标准曲线的线性回归方程（y=30726x−688902，R2=0.9996）计算绿原酸含量，结果以每g样品的绿原酸当量mg表示（mg CGA/g）。
1.2.2忍冬不同部位提取液抑菌谱的测定
1.2.2.1菌株的活化与培养
菌株培养基的选择与制备：L.acidophilus、L.plantarum、L.rhamnosus选用MRS肉汤培养基；A.acidoterrestris选用AAM培养基；S.agalactiae、L.monocytogenes选用BHI培养基；S.aureus、B.subtilis选用牛肉膏蛋白胨培养基；E.coli、Salmonella选用LB培养基；C.jejuni选用布氏肉汤培养基；K.marxianus选用YPD培养基。固体培养基均在液体培养基的基础上加入2%的琼脂粉，在121℃下高压灭菌15 min。菌株的活化：将冻藏菌株分别接种于相应液体培养基中，然后在37℃、250 r/min条件下振荡培养24 h（A.acidoterrestris培养温度为45℃），然后将菌液稀释涂布，静置培养18 h。菌株的培养：从各菌株平板上挑取一个单菌落，接种至10 mL培养基，过夜培养，然后以1.0%体积比转接至50 mL培养基中培养至对数期，最后稀释成1×106 CFU/mL的菌悬液，备用。
1.2.2.2忍冬不同部位提取液的制备
称取10 g样品，加入100 mL 60%乙醇，60℃、200 W超声水浴提取30 min，10000 r/min离心10 min，收集上清液，向沉淀中再次加入100 mL乙醇，超声水浴30 min后离心，重复3次。合并上清液，旋转蒸发浓缩至10 mL，即得浓度为1 g/mL的提取液。
1.2.2.3抑菌谱的测定
采用牛津杯法，将100μL菌悬液均匀涂布于固体培养基平板上，用牛津杯在平板上打孔，然后加入提取液100μL，于恒温箱中培养至肉眼观察到透明圈为止，无菌水作空白对照，用十字交叉法测定抑菌圈直径。
1.2.3忍冬不同部位提取液MIC和MBC的测定
采用二倍稀释法，用液体培养基对提取液进行二倍稀释，得到浓度为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg/mL的忍冬提取液。分别将100μL各浓度忍冬提取液加入100μL菌悬液，混匀后培养24 h，以澄清无浑浊的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）。培养基作对照，用于验证细菌正常生长，记为CK1；加入提取液而不加菌液，用于验证提取液是否受污染，记为CK2。在MIC的基础上，取培养液100μL均匀涂布于固体平板上培养48 h，以无活菌存在的最低浓度为最小杀菌浓度（MBC）。
1.2.4忍冬不同部位提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌生长曲线的影响
参考Cui等的方法，向菌悬液中加入金银花和忍冬叶提取液，至终浓度为1 MIC、2 MIC和MBC，不加提取液的作为对照组，45℃、250 r/min恒温振荡培养，每隔2 h取样测定OD600 nm值，绘制生长曲线。
1.2.5忍冬不同部位提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌细胞形态的影响
采用扫描电子显微镜（SEM）法，向菌悬液加入金银花和忍冬叶提取液，至终浓度为1 MIC、2 MIC和4 MIC，不加提取液的作为对照组，45℃、250 r/min培养8 h。4000 r/min，离心10 min，弃上清液，用无菌PBS清洗2次，用1 mL 2.5%戊二醇固定细胞形态。用PBS（0.1 mol/L，pH7.0）洗涤3次，然后使用一系列梯度浓度的乙醇（30%、50%、80%、90%和95%）进行脱水，每种浓度进行2次，每次15 min。脱水后在−20℃下预冻2 h，然后真空冷冻干燥。干燥完全后溅射镀金，在扫描电镜下观察。
1.2.6忍冬不同部位提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌生物膜形成能力的影响
采用结晶紫染色法，将200μL菌悬液置于96孔板中，加入金银花和忍冬叶提取液，至终浓度为1 MIC、2 MIC、4 MIC，不加提取液的作为对照组，45℃静置培养24 h。吸出培养液，用200μL无菌PBS（0.03 mol/L，pH7.2）洗涤3次，加入100μL甲醇，固定15 min后吸出。加入100μL 1%结晶紫溶液，染色15 min，将结晶紫溶液吸出，用PBS将颜色冲洗干净。加入100μL 33%CH3COOH溶液，用酶标仪测定OD590 nm值。
1.3数据处理
每组均进行3次平行实验，结果均以平均值±标准差表示。采用SPSS 23.0进行数据分析，Origin 9.0进行绘图。
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