辣木籽提取物制备、对蜡样芽孢杆菌的抑制作用及在在液态乳中的应用（一）
辣木（Moringaoleifera），辣木科辣木属植物，具有丰富的药用和食用价值，广泛种植于我国的云南、广东、广西、四川等地，以及印度、非洲、巴基斯坦等国家。辣木籽富含蛋白质、油脂、维生素等营养成分，同时含有黄酮、多酚、多糖等多种生物活性物质，具有抗氧化、抗炎、降血糖血脂、治疗糖尿病、护肝、抗癌等功能活性。辣木籽提取物是一种植物源天然抑菌剂，对念珠球菌、大肠杆菌、铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等不同真菌和细菌有抑制作用，其抑菌成分被认为主要是酚类、黄酮类物质。
蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus,B.cereus）是污染乳及乳制品主要的有害微生物之一，属重点防控生物性危害因子，不仅会引起胃病、呕吐、腹泻，还能通过分泌蛋白酶降低乳制品的营养价值，缩短产品的货架期。Zhao等从中国5个省份的500份乳制品样品中分离出54株蜡样芽孢杆菌，包括婴幼儿配方奶粉（14%）、原料奶（26%）、巴氏杀菌奶（24%）、超高温奶（16%）和奶酪（20%）。另外，巴氏杀菌对孢子的杀灭率低，国内外研究发现蜡样芽孢杆菌仍存在于市售巴氏乳中，其毒力基因对人体健康存在威胁。目前，加热杀菌是保障乳品安全的主要技术手段，但过度加热会破坏乳中热敏性营养成分，因此在温和杀菌方式下，利用天然抑菌成分延长乳品保质期是乳品加工新技术的重点。已有研究表明，大蒜精油和乳酸链球菌素对乳中蜡样芽孢杆菌有抑制作用，但天然抑菌剂应用于乳及乳制品中的具体抑菌效果仍需要进一步探究。
本研究以辣木籽为原料，采用超声辅助提取法制备辣木籽提取物，以蜡样芽孢杆菌为指示菌，通过响应面法，以抑菌圈大小为评判标准，评价辣木籽提取物的抑菌活性，明确温度、pH值和紫外线照射对提取物抑菌稳定性的影响，并研究辣木籽提取物在全脂乳和脱脂乳中的实际抑菌效果，以及对液态乳色度、风味、黏度的影响，为辣木籽提取物在液态乳中的应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
辣木籽购自云南帅润科技有限公司；三株芽孢杆菌属新型ST分离株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，B.cereus）ST-1351、ST-1350、ST-1349由乳品加工质量安全工程技术实验室分离自市售羊乳及其生产线；全脂乳粉、脱脂乳粉恒天然集团安佳；营养肉汤、琼脂索莱宝试剂公司；无水乙醇、丙酮、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯所有分离用的有机溶剂均为国产分析纯。
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1.2实验方法
1.2.1菌悬液制备
将冻存在−80℃的蜡样芽孢杆菌采用划线法在营养肉汤琼脂培养基活化2次，挑单菌落接种于5 mL的营养肉汤中，37℃培养20 h，使细菌处于对数生长期。培养后的菌悬液经离心（8500×g，10 min）去除上清液，使用生理盐水洗涤菌体3次，随后使用一定量的生理盐水悬浮菌体沉淀，测定并调整菌悬液的OD600nm=0.5，使菌悬液浓度约为108CFU/mL。
1.2.2辣木籽提取物制备及单因素实验
将辣木籽去壳粉碎过60目筛，准确称取辣木籽粉末1.00 g，用冰乙酸和氨水调节pH至5，加入50 mL蒸馏水超声15 min后，30℃条件下浸提2 h，在此基础上设置单因素实验，考察不同提取条件对辣木籽抑菌活性的影响，以抑菌圈为指标，分别考察提取溶剂（蒸馏水、无水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、石油醚）、pH（2、3、4、5、6、7）、料液比（1:10、1:30、1:50、1:70、1:90、1:110 g/mL）、浸提温度（10、20、30、40、50、60℃）、浸提时间（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）5个因素对辣木籽抑菌活性成分制备的影响。提取液过滤后于40℃旋蒸至恒重，复溶并定容至浓度为0.1 g/mL。
1.2.3抑菌圈的测定
根据石超的方法稍作修改，量取15 mL营养肉汤培养基至无菌培养皿中，冷却凝固后备用。将制备好的菌悬液用生理盐水稀释至107CFU/mL，取100μL菌悬液均匀涂布至培养基上，将牛津杯（外径8 mm、内径6 mm、高10 mm）至于培养基上，调整牛津杯位置并轻轻按压，每个培养皿中均匀放置3只牛津杯。向牛津杯中加入经0.22μm无菌滤器过滤后的100μL辣木籽提取物。以1 mg/mL青霉素G钠为阳性对照，37℃培养20 h后，用游标卡尺测量抑菌圈大小。
1.2.4响应面试验设计
根据单因素实验结果，ST-1349菌株对辣木籽提取物抗性较强，为达到最好抑菌效果，故选取ST-1349菌株为试验菌株，以蒸馏水为提取溶剂，对pH、料液比、浸提温度、浸提时间四个主要影响因素设计响应面优化试验(表1)，以抑菌圈大小为响应值，利用Box-Behnken Design进行四因素三水平响应面设计，优化辣木籽抑菌成分提取的工艺条件，从而得到最佳提取工艺。
表1响应面因素水平编码表
1.2.5最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定
最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）和最小杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）的测定参照Kang等的方法，将营养肉汤培养基冷却至50℃左右后，加入24孔板，并添加辣木籽提取物使其浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 mg/mL。接种2μL浓度为108CFU/mL的菌悬液于24孔板，以1 mg/mL的青霉素G钠为阳性对照，将样品于37℃培养，MIC和MBC分别为24 h和48 h后蜡样芽胞杆菌不生长的辣木籽提取物浓度。