草鱼呼肠孤病毒培养与滴度测定、及在草鱼、CIK细胞上的生长特性研究（二）
1.3.3灵敏性试验及标准曲线绘制对重组质粒10倍梯度稀释后，进行荧光定量PCR扩增。参照SYBR Green荧光定量试剂盒说明书，分别取稀释好的重组质粒1μL为模板进行PCR扩增。反应体系为：2×SYBR GreenⅠPCR反应混合液10μL，10 pmol/L的上、下游引物各1μL，加ddH2O补足20μL。反应采用三温循环，程序为：95℃预变性10 s；95℃变性5 s，56℃退火30 s；72℃延伸15 s，40个循环，并收集荧光信号。
1.3.4特异性试验分别取GCRV 873毒株、传染性造血器官坏死症病毒（IHNV）、鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）核酸，以其为模板进行Realtime PCR扩增，20μL体系加模板1μL，并设立阴性对照。
1.4病毒培养与滴度测定
将保存于液氮中的GCRV 873毒株接种于长成致密单层的CIK细胞，28℃吸附1 h；吸弃病毒液，加入与培养液等量的维持液（含2%FBS的M199），28℃恒温培养。每日观察细胞形态，直至出现80%细胞病变，收取病毒液进行滴度测定。GCRV873的细胞培养液经反复冻融后作连续10倍梯度稀释，取10-3～10-108个稀释度，每个稀释度取100µL的病毒液接种于96孔板上的单层CIK细胞；每稀释度接种8孔，28℃孵育1 h后弃去，加入维持液继续培养，并设正常细胞为对照，连续观察7 d。根据病变情况，按Karber氏法计算半数组织培养感染剂量（TCID50）。lgTCID50=L+d（s−0.5）。式中：L为病毒最低稀释度的对数，d为组距（稀释系数），s为各组病变数与接种数比值之和。
1.5 GCRV 873株在CIK细胞上的生长特性研究
CIK细胞培养于24孔细胞板，待细胞长至致密单层时，弃去培养液，用1×104TCID50/mL，每孔100μL的GCRV 873毒株感染细胞。感染后分别于0、2、4、8、10、12、24、36、48、72 h收取病毒细胞培养液，应用建立的Real-time PCR方法检测定各时间点的病毒RNA增殖情况，并通过对各个时间点病毒滴度的测定，检测病毒拷贝数，同时分别显微镜观察0、12、24、36、48、72 h的CIK病变情况。
1.6 GCRV 873株在草鱼体内的生长特性研究
试验鱼用MS222溶液（1 mg/L）麻醉，每尾草鱼腹腔注射TCID50为1×106的GCRV 0.1 mL，对照组每尾注射同等剂量的灭菌生理盐水。于注射后1、2、3、5、7 d取样，每组随机选取4尾试验鱼，用MS222（1 mg/L）麻醉后，取其肝脏、脾脏、肾脏，用Trizol提取各组织RNA后反转录为cDNA，应用Real-time PCR方法测定肝脏、脾脏、肾脏中的病毒含量。
1.7数据分析
荧光定量PCR反应结束后，查看扩增曲线和Ct值等；通过标准曲线换算得到样品中内参基因β-actin和病毒基因组的绝对拷贝数，再经β-actin校正得到相应的相对拷贝数。
2结果
2.1 Real-time PCR检测方法的建立
用特异性荧光定量引物VP6-U/VP6-L对病毒核酸进行PCR扩增，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现扩增片段与预期大小（102 bp）一致，且特异性好（图1）。将扩增片段克隆到pMD-18T后送测序，发现序列与Genebank上公布的序列一致。从不同稀释度的标准品Real-time PCR扩增反应（图2）可以看出，从1×101～1×106个拷贝数的质粒扩增曲线均呈“S”型，且与指数增长期的扩增曲线平行，反映出PCR的扩增效率相近，检测灵敏度为1×101个病毒粒子。以质粒拷贝数的对数为X轴，以Ct值为Y轴，根据两者的相关性得到标准曲线Y=3.237×log（X）+39.63，其相关系数R2为0.999，扩增效率为103.7%。特异性试验结果显示（图3），GCRV病毒核酸扩增曲线呈“S”型，而IHNV、SVCV及阴性对照均没有扩增曲线，说明所建立的检测方法特异性好。
图1引物VP6-U、VP6-L PCR扩增结果
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