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大黄鱼病原性哈维氏弧菌在试验菌发酵上清液拮抗下的生长曲线

来源:饲料工业 发布时间:2024-02-21 06:12:44 浏览:44 次

本文用点种法定性初筛、酶标法及牛津杯法定量复筛,从实验室保存的在海洋生物体中分离得到的未知海洋微生物中筛选对大黄鱼病原性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)具有较强拮抗作用的拮抗菌,并从抗菌谱、生长优势、药敏检测、碳源利用等方面进一步分析目的拮抗菌作为益生菌的特征,以期为大黄鱼弧菌病防治及益生菌的开发提供可参考的菌种。


生长曲线绘制


根据酶标仪所测OD630值绘制生长曲线,选取生长曲线上最陡的7个点做生长曲线拟合度直线,直线斜率即为最大生长率(μ),直线在X轴上的截距为延滞生长期(λ),生长曲线稳定期切线在Y轴上的截距为最大生物量(A)。根据公式Td=ln2/μ求得倍增时间(Td),根据公式RI/100=I/(λ×Td),求得各菌株生长参数(RI)。


拮抗菌的筛选


用点种法在实验室保存的65株未知的海洋微生物菌株中,获得18株出现抑菌圈的初筛拮抗菌。酶标法复筛,从生长曲线对比图1(a,b,c,d)可看出各试验菌的拮抗效果。在试验菌发酵上清液拮抗下的指示菌生长曲线居于空白指示菌生长曲线之下的均可能存在拮抗效果。因此,初步确定X15、Y13、Y26、Y36、Z10、X14、Z5、Z9、Y9、Z11、Y27、Z4、Y25、Y24、Z6、Z1具有对指示菌哈维氏弧菌的拮抗作用。

图1指示菌在试验菌发酵上清液拮抗下的生长曲线对比图(a,b,c,d)


通过用牛津杯法直接测量抑菌圈直径大小,并经过计算机数据分析,计算均值及标准误差如表1所示,可间接得出酶标法测得的16株试验拮抗菌对指示菌哈维氏弧菌的拮抗效果,从而确定最佳目的拮抗菌为X14菌株和X15菌株。

表1牛津杯法测得抑菌圈直径(cm)


益生菌生长曲线


如表2所示,列出了从两株拮抗菌和两株病原弧菌生长曲线中推导得到的生长参数,从中可看出两拮抗菌最大生长率较两株病原菌大,但最大生物量较两株病原菌小,延滞期也都较病原菌小,倍增时间都小于两株病原菌。RI值较大的菌株具有短的延滞期和短的倍增时间,具有生长优势。两株拮抗菌在相同的条件下可能较两株病原菌更具生长优势,且X14生长优势强于X15。

表2两株拮抗菌和两株病原弧菌生长曲线参数


结论


用点种法定性初筛、酶标法和牛津杯法定量复筛,从海洋生物体上获得的65株菌中筛选出2株具有较高抗病原哈维氏弧菌的菌株X14、X15为目的拮抗菌。在对两株益生菌特征分析的研究中,抗菌谱及生长曲线结果显示菌株X14、X15具有较广的抗菌性,且两株拮抗菌在相同的条件下可能较两株病原菌更具生长优势。药物敏感性试验结果表明,分离菌株对四环素、环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林、头孢噻肟、复方新诺明、头孢噻吩、利福平、萘啶酸、阿莫西林等10种药物敏感。16S rDNA基因同源性分析的结果显示与X14、X15同源性达99%以上的菌株均来自链霉菌属(Streptomyces),进一步建立系统发育树,结果显示菌株X15与灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)相似性最高,但结合形态特征及理化性质不能将两菌株确定到种。筛选得到的菌株X14、X15在拮抗病原哈维氏弧菌、抗菌谱、生长优势及药敏性等方面均初步满足益生菌的筛选条件。

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