量化人类肠道菌种对艰难梭菌长期生长的影响（四）
关键的突变在艰难梭菌中显著改变了代谢活动
因为进化型艰难梭菌的突变可能影响代谢活动，我们对高碳水化合物环境下进化型和原始型艰难梭菌菌株的exo-代谢组学特征进行了表征(见图3B和S7F)，以及限碳水化合物环境下的exo-代谢组学特征(见图S5)。尽管原始菌株在代谢方面已知能够利用脯氨酸，但进化型菌株在基础培养基中并未显著消耗脯氨酸(见图3B)。相反，进化型菌株比原始菌株更有效地利用甘氨酸、天冬氨酸和N-乙酰甘氨酸。与此相反，进化型艰难梭菌在限碳水化合物培养基中的单菌种和与PV共培养条件下，脯氨酸的利用率显著降低，其他氨基酸如甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丝氨酸的消耗率显著提高(见图S5D)。此外，在两种培养基条件下，进化型菌株的葡萄糖消耗量也高于原始菌株(见图3B和S5D)。
为了探讨这些突变如何影响艰难梭菌基因表达谱，我们在基础培养基中无PV和有PV条件下，对原始型和进化型艰难梭菌菌株进行了基因组范围转录组分析(见图3C、S9A和S9B)。在3,508个总基因中，89个和55个在进化型艰难梭菌中显著高表达和低表达，分别高于原始菌株(见图3D和3E；表S8)。PTS相关基因，包括突变的基因206，在进化型菌株中显著高表达。这表明，进化型菌株在转运和磷酸化碳水化合物方面适应性更强，促进了如葡萄糖等碳水化合物的高效利用(见图3B)。尽管prdR表达变化不大(1.4倍上调)，但prd和grd操纵子的表达发生了显著变化。特别是甘氨酸还原酶编码基因显著上调(2.1-至305倍)，而脯氨酸还原酶编码基因则显著下调(3.0-至9.7倍)，与原始菌株相比(见图3E)。这一结果与exo-代谢组学结果一致，显示了进化型菌株在脯氨酸和甘氨酸利用方面的变化(见图3B)。
一些代谢基因，如负责Wood-Ljungdahl路径(WLP)碳羰基分支的一氧化碳脱氢酶/乙酰-CoA合酶复合体，能够将CO?转化为乙酰-CoA，在进化型菌株中比原始菌株高表达(见图3E)。WLP是最重要的能量产生和碳固定代谢之一，其中两个CO?分子作为终端电子受体被还原为乙酰-CoA，进而转化为乙酸。除此之外，包括thlA1、hbd、crt2(将乙酰-CoA转化为丁酰-CoA)以及ptb和buk(将丁酰-CoA转化为丁酸)的生产丁酸基因在进化型菌株中显著高表达。与这些基因表达模式一致，进化型菌株丁酸生产能力比原始菌株高出2.7倍(见图S9G)。作为一个参考，这种增强的丁酸生产能力(11.6 mM)与在类似培养基中培养的主要丁酸生产菌科普罗科科斯(Coprococcus comes)相当，可能在体内影响疾病严重程度。此外，先前的研究表明某些拟杆菌属显示出对丁酸的营养特异性生长敏感。在3种拟杆菌属中(PV、BT、BU)，只有PV在响应中等浓度的丁酸时显示出显著的生长抑制。进化型菌株产生的丁酸浓度位于PV丁酸-剂量响应曲线的低抑制区域(见图S9H)。
在与PV共培养时，无论是原始菌株还是进化型艰难梭菌菌株均上调了丁酸发酵基因，而进化型菌株的这些基因表达更高(见图S9C–S9E；表S9–S11)。由于培养基中不含丁酸，这表明了PV的交叉喂养现象，与有机酸测量结果的模式一致(见图2C和2D)。值得注意的是，在进化型艰难梭菌菌株存在下，PV显示出了许多与氨基酸生物合成相关的基因高表达，而与原始菌株相比(见图S7B和S9F)。进化型艰难梭菌菌株消耗了比原始菌株更多的氨基酸(甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)(见图S5D)。这表明，PV向进化型艰难梭菌菌株的氨基酸交叉喂养可能比与原始菌株相比得到了增强(见图S7B和S7C)。
进化型艰难梭菌菌株的生长受甘氨酸限制较小，对高葡萄糖浓度表现出增强反应
一个关键未解的问题是，这些代谢适应如何影响艰难梭菌在不同环境中的适应性(fitness)。为了评估适应性变化，我们研究了进化型和祖先型艰难梭菌菌株在不同氨基酸浓度下的生长情况。在氨基酸浓度降低(20%)的早期时间点，进化型艰难梭菌菌株的生长表现出显著的优势，而在其他条件下，两者的生长反应类似(图S7D)。
进化型艰难梭菌菌株的脯氨酸EC50(脯氨酸浓度，能够达到最大生长的50%)显著低于祖先型菌株(图S10A和S10E)。这一结果表明，进化型菌株在低脯氨酸浓度下的竞争效率显著高于祖先型菌株。脯氨酸在我们实验条件下是祖先型艰难梭菌菌株的生长限制资源，这与其他具有多样基因组的艰难梭菌菌株一致。然而，进化型菌株对脯氨酸的需求显著低于祖先菌株，正如我们代谢组学数据(图3B)所示。与这一结果一致，在PV共培养中，进化型菌株的丰度不随脯氨酸浓度变化，这表明其生长处于脯氨酸浓度的饱和状态(图S10G)。相比之下，祖先型菌株的丰度随着脯氨酸浓度的增加而增加(即脯氨酸剂量反应的线性状态)。在低初始脯氨酸浓度下，进化型艰难梭菌菌株在12小时共培养中的丰度高于祖先型菌株，最终在实验结束时下降(图3F)。由于进化型菌株比祖先菌株更能消耗甘氨酸(图3B)，我们还研究了其对不同浓度甘氨酸的生长反应。在单培养(图S10B和S10D)以及共培养PV(图S10H)条件下，进化型和祖先菌株的生长响应显示出类似的趋势。
虽然进化型艰难梭菌菌株的葡萄糖EC50值高于祖先菌株，但进化型菌株在高葡萄糖浓度下表现出更高的生物量(即更高的最大生长产量，图S10C和S10F)。这种生物量的增加并未通过单细胞水平上细胞大小和形态的变化来解释(图S7E)。这些发现暗示了在葡萄糖的生长产量和敏感性之间存在权衡。总之，进化型艰难梭菌菌株的代谢活动改变影响了其在不同脯氨酸和葡萄糖组合环境中的适应性(图3G、3H和S11)。在高葡萄糖和低脯氨酸浓度条件下，相比祖先菌株，进化型菌株的适应性得到了增强。在某些环境中，这种适应性改变可能使进化型菌株在定殖过程中优于其他菌株，从而可能影响疾病结果。
进化型艰难梭菌菌株显示出与人类肠道菌群的种间交互作用的变化
艰难梭菌代谢的显著变化将影响人体肠道微生物群种间的交互作用。为了探讨这些关键突变如何影响生态网络，我们构建了包含进化型或原始艰难梭菌菌株的2-8成员群落的96种组合。其他种类(CS、CH、DP、BT、PV、BU和CA)在长期培养实验中使用，广泛分布于不同个体之间，涵盖了人类肠道微生物群的系统发育多样性，并在不同环境中被广泛研究(图4A)。我们将gLV模型拟合到物种绝对丰度的时间序列数据(表S3 DATASET002；图S12A、S13A和S13B)。为了评估模型对未使用数据的预测性能，我们进行了20倍交叉验证(图S12B；STAR Methods)。模型预测与测得的物种丰度之间的吻合度良好(Pearson’s R=0.95–0.99,p<10E?05)。
图4|关键代谢基因突变改变了艰难梭菌与人体肠道微生物群种间的交互作用
(A)工作流程示意图，用于解析艰难梭菌祖先株和进化株与人体肠道微生物之间的交互作用(STAR方法；表S3 DATASET002)。
(B和C)7种肠道微生物与祖先(B)和进化(C)艰难梭菌株之间的推断种间交互网络。节点大小代表各物种的载体容量，边的宽度表示种间交互系数(aij)的大小。热图显示了社区中8种物种之间的aij。
(D)祖先株与进化株艰难梭菌株的社区之间aij的散点图。灰色(蓝色)数据点是两种肠道微生物之间(艰难梭菌与肠道微生物)的aij。蓝色虚线表示两社区aij值之间的线性回归。两侧皮尔逊相关系数r和p值显示。