脓肿分枝杆菌胞内菌落计数、对RAW264.7细胞血红素氧化酶1调控自噬影响（一）
摘要
目的：探讨血红素氧化酶1（HO-1）调控自噬对脓肿分枝杆菌（M.abs）胞内生长的影响。
方法：M.abs标准株ATCC19977按照指定的感染复数（MOI）刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞特定时间，Western blot检测HO-1蛋白表达水平和自噬相关蛋白Atg5、LC3Ⅱ、p62蛋白表达水平。采用HO-1特异性诱导剂CoPP和酶活性抑制剂SnPP预处理巨噬细胞12 h，加入M.abs共孵育2 h，阿米卡星去除胞外菌后继续培养至指定时间，CCK-8法检测细胞活性；Western blot、LysoTracker Red检测HO-1蛋白与自噬相关蛋白的调节关系；菌落计数、ELISA分别检测细胞内细菌存活情况和TNF-α分泌水平。
结果：与对照组相比，M.abs能诱导HO-1和Atg5、LC3Ⅱ、p62蛋白表达水平升高；HO-1过表达和抑制能有效调控M.abs诱导的Atg5、LC3Ⅱ和p62表达。LysoTracker Red、菌落计数和ELISA结果显示，SnPP促进细胞内溶酶体增加，显著抑制M.abs胞内繁殖并减少TNF-α分泌。
结论：抑制HO-1能增强M.abs诱导的自噬流，减少M.abs胞内生长，为研发以抑制HO-1为靶点的靶向药物提供科学依据。
非结核分枝杆菌是除了结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌外的分枝杆菌的总称，也称为非典型分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）。脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus，M.abs）是临床NTM分离株中最为常见的菌种之一。细菌对传统药物耐药性高，需多种药物联合使用，治疗疗程长，不良反应多，预后较差，被临床认为是最难治疗的感染性疾病之一。目前，有文献提出积极治疗病原体和提高机体免疫调节并重的M.abs感染的治疗方案。因此，研究以宿主导向治疗（host-directed therapies，HDT）为核心的免疫治疗手段可能是将来对M.abs治疗的重点。自噬是机体为维持细胞内环境稳态而对受损蛋白进行分解代谢的一种固有免疫机制，可能是未来治疗M.abs临床应用的方向之一。典型自噬主要包括吞噬泡的形成、自噬体的形成、自噬溶酶体形成和降解。研究表明，机体自噬增强对细菌感染的清除具有重要意义，如人中性粒细胞可通过增强自噬途径杀灭胞内类鼻疽伯克霍尔德菌。虽然机体可通过自噬清除胞内菌，但一些胞内菌也衍生出阻断自噬流的策略，导致自噬无法完成生物学功能。KIM等发现M.abs临床分离株可通过抑制自噬溶酶体融合促进其自身在胞内存活。因此，寻找到一种关键蛋白能有效调节自噬，可能为M.abs感染性疾病的免疫治疗提供一种新的途径。
血红素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是能催化游离血红素降解为一氧化碳、亚铁离子和胆绿素，对细胞和组织具有保护作用的酶，其催化产物一氧化碳和胆绿素均证明具有抗炎作用。然而HO-1在M.abs感染性疾病中具有不同作用。ABDALLA等证实抑制HO-1能有效抑制M.abs胞内存活，给予HO-1催化产物可恢复M.abs胞内繁殖。说明HO-1对于M.abs胞内增殖起到关键作用。SO和OH研究发现，siRNA干扰HO-1有效提高细胞LC3Ⅱ表达，Atg5 siRNA干扰癌细胞可诱导HO-1大量表达。说明HO-1与宿主自噬存在调节关系。但是HO-1对M.abs诱导自噬和溶酶体调节作用尚不清楚。基于HO-1在M.abs胞内增殖和细胞自噬中起到重要作用，本研究探讨了HO-1对M.abs诱导自噬的调控关系及调控结局的影响，为后续抗菌药物的研发提供科学理论和实验依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞和菌株来源
鼠源性RAW264.7细胞购于上海细胞库细胞宝藏中心；M.abs标准株ATCC19977粗糙型（R型）由北京结核病诊疗技术创新联盟惠赠。