国内新发病原牛疱疹病毒4型(BoHV-4)qPCR鉴定、分离及一步生长曲线测定（三）
2结果与分析
2.1分离病毒的细胞病变观察
通过qPCR检测收集到的30份生殖道拭子样本，其中9份样品为BoHV-4阳性。对阳性样本进一步检测均显示为BoHV-1和BVDV阴性。将9份BoHV-4阳性样本分别接种HeLa细胞，48 h后其中一个接种孔显示出明显的细胞病变，部分细胞出现圆缩，空泡化细胞增多，同时可观察到细胞聚集，呈现出疱疹病毒典型的“葡萄串”样病变(图1)。阴性细胞正常，无细胞病变。随后收集培养物，冻融3次后继续传代，传至第3代，细胞病变稳定存在。
图1 BoHV-4在HeLa细胞上产生的细胞病变(红色箭头所指为细胞病变)
2.2病毒分离株的鉴定
2.2.1分离株TL01的qPCR鉴定结果
收集传代3次并稳定出现细胞病变的细胞培养物，提取核酸后进行qPCR检测(图2)。Ct值为22.35，阴、阳性对照成立，可以确定分离到的病毒为BoHV-4，且扩增BoHV-1和BVDV的qPCR结果为阴性，表明病毒分离传代过程中无BoHV-1和BVDV污染，纯净性良好。
图2分离病毒的qPCR扩增曲线
2.2.2病毒感染细胞的间接免疫荧光鉴定
以制备的BoHV-4 gB蛋白小鼠多克隆抗体为一抗，FITC标记的羊抗小鼠IgG为二抗，孵育完后对DAPI染色细胞核进行间接免疫荧光观察。荧光显微镜下显示，感染TL01的细胞中出现明显的特异性绿色荧光，且绿色荧光信号与细胞病变一致，未感染病毒的阴性细胞中未出现绿色荧光(图3)。
图3病毒感染细胞的间接免疫荧光试验鉴定
2.2.3病毒粒子的电镜观察
收集病毒感染后的细胞固定后制作超薄切片，电镜图片如图4所示。在电子显微镜下可观察到明显的球形颗粒，有囊膜，包装完整的病毒粒子大小为150～200 nm，符合疱疹病毒的形态特征。图4中可观察到细胞质中包装完整的病毒颗粒以及包装完成后即将释放到细胞间隙的病毒颗粒。
图4 TL01毒株的扫描电镜观察
2.2.4病毒生长曲线测定
为测定病毒生长动力学，HeLa细胞在指定时间点以MOI为0.1接种TL01。病毒滴度在6～36 h呈上升趋势，在感染后36 h达到峰值(106.3 TCID50·mL-1)后下降(图5)，表明TL01可以在HeLa细胞中有效感染和复制。
图5 TL01的生长曲线
2.3分离病毒gB和TK基因的遗传演化分析
对TK和gB基因进行扩增，电泳鉴定结果如图6所示，TL01各基因片段与预期相符。对胶回收产物纯化后测序获得TL01的TK(GenBank ID:PP534476)和gB基因序列(PP534477)。BLAST搜索与其他BoHV-4毒株的相应序列有99%以上的同源性。
图6 gB和TK基因PCR扩增产物的鉴定
利用系统发育分析软件MEGA 11将TL01分离株gB和TK基因与GenBank中收录的BoHV-4毒株相应基因型进行序列比对并构建系统发育树。如图7所示，基于gB基因的系统进化分析表明，TL01的gB基因与BoHV-4的基因2型代表毒株DN599的遗传距离最近，在系统发育树上的Bootstrap值为91%。同时与其他3株gB基因属于BoHV-4的基因1型的中国分离株512、B6010、J4034的亲缘关系较远。基于TK基因的系统进化分析表明，TL01株的TK基因与基因1型代表毒株Movar33/63以及其他3株TK基因属于基因1型的中国分离株512、B6010、J4034的亲缘关系较近，在系统发育树上的Bootstrap值为93%。
图7基于gB(A)和TK(B)基因编码氨基酸序列的系统发育分析
3讨论
BoHV-4属于疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科的成员，其感染动物后的临床症状主要与成母畜的繁殖障碍或生产性能下降相关，此外，BoHV-4感染最终导致胎盘细胞损伤和功能障碍，可能引发子宫的病变，并诱发流产，对畜牧业造成威胁。BoHV-4首次分离自匈牙利1至4月龄犊牛的呼吸系统疾病和结膜炎病例，并随后在巴西、意大利、阿根廷等国家报道。2021年，该病毒在我国首次分离。目前国内没有针对该病原诊断和防控的国家标准和行业标准，也没有相应商品化疫苗生产，需要重视其流行病学特征及诊断和防控技术的研发。
目前对于BoHV-4的流行病学研究主要以血清学调查为主。1989至2005年，BoHV-4的全球血清阳性率在养牛场为4.2%～30%。在我国，从内蒙古自治区采集的70份牛血清中，有64%存在抗BoHV-4抗体。2023年，我们采集了东北地区某牧场12月龄荷斯坦牛的生殖道拭子并进行检测，BoHV-4阳性率为30%，且未发现BoHV-1和BVDV的混合感染，提示BoHV-4可能在该牧场内发生传播。目前BoHV-4在国内的流行病学研究较少，因此需要进一步流行病学调查为该病原的生物防控提供参考依据。
TL01株虽然可以在HeLa细胞上引起典型的细胞病变，但不产生噬斑，无法采用挑取空斑的方式对其进行纯化，这可能是由于病毒不会杀死它们的宿主细胞，使其裂解、脱落产生空斑。为确保该病毒分离及传代过程中的纯净度，在样本采集时需要检测是否还含有其他与生殖道疾病相关的病原，如BoHV-1、BVDV。普通PCR的敏感度较低，而染料法qPCR会出现一些非特异性扩增或引物二聚体影响结果准确性，因此，在试验前期建立了针对BVDV、BoHV-1、BoHV-4特异性和准确性更高的探针法，确保分离毒株的纯净性。
限制性酶切法是BoHV-4经典的基因分型方法。gB和TK基因在疱疹病毒科成员中高度保守，已被广泛用于分析BoHV-4毒株的基因型。因此，选择扩增gB和TK基因构建系统发育树，结果表明，TL01的gB基因属于DN599-like型，特别的是它与NCBI上的3株中国分离株属于不同的分支。由于gB蛋白是在病毒膜上最丰富的蛋白之一，其编码基因是疱疹病毒科成员中最保守的一个基因，在病毒复制中是必需的，这种差异对病毒的吸附和侵入会有哪些影响，值得进一步研究。TK基因是病毒毒力基因，也是病毒复制的非必需基因，但对病毒维持神经组织的持续感染十分重要。TL01的TK基因与这3株中国分离株同属于Movar33/63-like型，与gB基因分型不同，这可能是由于在遗传进化过程中发生了病原内部的基因重组，表明BoHV-4遗传进化的复杂性。TL01株的基因重组及分型情况依赖全基因组序列的测定与深入分析。