脓肿分枝杆菌胞内菌落计数、对RAW264.7细胞血红素氧化酶1调控自噬影响（二）
1.1.2主要试剂和仪器
高糖DMEM培养基购于普赛诺公司；Cobaltic ProtoporphyrinⅨChloride（CoPP）（Cat#sc-294098）、Tin ProtoporphyrinⅨdichloride（SnPP）（Cat#sc-203452）购于美国Santa cruz公司；抗LC3Ⅰ/Ⅱ抗体（Cat#12741S）、抗ATG5抗体（Cat#12994）、抗GADPH抗体（Cat#5174）、第二抗体抗兔IgG抗体（Cat#7074S）购于美国CST公司；HO-1（Cat#10701-1-AP）购于Proteintech公司；SQSTM1/p62（Cat#AG4400）、特级胎牛血清（Cat#13011-8611）购于碧云天生物技术公司；CCK8（Cat#K1018）、3-MA（Cat#A8353）购于APEXBIO公司；LysoTracker Red DND-99（Cat#MX4317-50UL）购于懋康生物技术有限公司；DAPI购于Bioss公司；TNF-α（Cat#87E2072700）为云克隆产品；6孔板购于NEST公司；阿米卡星注射液购于宜昌人福药业有限公司。显影胶片（Cat#YA0360）为柯达公司产品；蛋白电泳槽为Bio-Rad公司产品；转膜仪为北京六一生物科技有限公司产品；免疫荧光显微镜为Nikon DS-Qi2型号。
1.2方法
1.2.1 M.abs培养及准备
将M.abs标准株ATCC19977接种于7H9液体培养基，培养3~5 d，取对数生长期细菌，调整细菌浓度1.5×108 CFU/ml，用于后续实验。
1.2.2 RAW264.7细胞培养及M.abs刺激
RAW264.7细胞培养于含10%FBS的高糖DMEM培养基。当细胞浓度达到80%贴壁时，无菌PBS清洗3次，含0.2%EDTA胰酶消化2 min，调整细胞密度为2.5×105个/ml，取2 ml铺于6孔板，待细胞完全贴壁后，加入30μmol/L CoPP或30μmol/L SnPP预处理12 h，在RAW264.7巨噬细胞培养基内分别以感染复数（MOI）（M.abs∶RAW264.7）为5∶1、10∶1和15∶1比例加入M.abs刺激2 h（活菌浓度分别为：2.5×106 CFU/ml、5×106 CFU/ml、7.5×106 CFU/ml），无菌PBS漂洗3次，加入含34μg/ml阿米卡星完全培养基作用2 h去除胞外菌，无菌PBS漂洗3次，继续培养至指定时间，收集不同时间点细胞蛋白保存于-20℃待测（蛋白提取见1.2.4）。
1.2.3 CCK-8检测细胞活性
CCK-8检测参照试剂说明书进行，简要操作如下：调整RAW264.7细胞密度2.5×105个/ml，吸取100µl铺于96孔板，待细胞完全贴壁后，加入终浓度为30μmol/L CoPP和30μmol/L SnPP处理48 h或直接加入M.abs共孵育48 h，处理完毕后，分别加入CCK-8检测溶液10μl，继续培养4 h，检测A450。细胞活力（%）=（实验组吸光度-空白组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）×100%。所有实验浓度均设3个复孔，重复3次，取平均值计算。
1.2.4 Western blot
细胞按照实验设计方案处理结束后，每孔加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂coctail的RIPA缓冲液200µl，收集细胞并置冰上裂解30 min，将蛋白裂解液于4℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清用BCA蛋白测定试剂盒检测待检样本浓度，置于-20℃冰箱保存。取20μg蛋白与5×蛋白上样缓冲液混合，置于100℃金属浴5 min，取等量制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后，将蛋白通过转膜仪转移到0.45μm PVDF膜上，PBST稍微漂洗后用5%脱脂牛奶封闭1 h，孵育一抗4℃过夜（抗HO-1抗体、抗ATG5抗体、抗LC3Ⅰ/Ⅱ抗体、抗p62抗体和抗GAPDH抗体），PBST漂洗3次，每次5 min。孵育相应的二抗，室温放置1 h，再次用PBST漂洗3次，每次5 min。ECL显影液进行显影。采用Image J软件进行灰度分析。
1.2.5 LysoTracker Red染色
调整细胞浓度2.5×105个/ml，并取1 ml接种到含细胞爬片的12孔板中，待细胞完全贴壁后，按照实验设计CoPP和SnPP预处理细胞12 h，加入M.abs（MOI=5）共孵育2 h，无菌PBS洗3次，重新加入含LysoTracker Red（200 nmol/L）完全培养基继续培养1 h，无菌PBS洗3次后，加入DAPI染液进行细胞核染色10 min，免疫荧光显微镜进行细胞观察并拍照保存，采用Image J软件对各组进行量化分析。
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