基于革兰氏阳性菌生长曲线等指标评价纤维素基抑菌材料L-Met改性MCC（M-MCC）抑菌效果（二）
1材料与方法
1.1材料与试剂
L.monocytogenes购自美国农业部食品安全检验局；S.aureus购自美国模式培养物集存库。
MCC上海沪试实验室器材股份有限公司；高碘酸钠、2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2，2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、L-Met、过硫酸钾、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（均为分析纯）上海麦克林生化科技有限公司；甲醇（色谱纯）、二甲基亚砜（分析纯）、乙二醇（分析纯）广东光华科技股份有限公司；硼氢化钠（分析纯）江苏强盛功能化学股份有限公司；无水乙醇（分析纯）无锡市亚盛化工有限公司；盐酸（分析纯）南京化学试剂股份有限公司。
1.2仪器与设备
JJ2000B电子天平常熟双杰测试仪器厂；524G恒温磁力搅拌器上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；DHG-9240A电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；SCIENTZ-10N冷冻干燥机宁波新芝冻干设备股份有限公司；FE28 pH计、电导率仪瑞士Mettler Toledo公司；恒温培养箱宁波江南仪器设备有限公司；BKQB75L高压蒸汽灭菌锅山东博科生物产业有限公司；M2E全波长酶标仪美国BioTek公司；紫外分光光度计上海精密科学仪器有限公司；LL 600300傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪美国PerkinElmer公司；Sigma 300扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）、LSM900激光共聚焦显微镜德国Zeiss公司。
1.3方法
1.3.1 M-MCC的合成总流程
M-MCC的制备总流程如图1所示。
图1 NaIO4氧化法制备M-MCC总流程
1.3.2 MCC的氧化活化
原始的MCC样品性质较为稳定，难以直接进行接枝。需采用高碘酸钠氧化法对MCC进行开环氧化，生成双醛基纤维素（dialdehyde cellulose，DAC），再进行下一步的接枝。
MCC氧化成DAC的步骤如下：准确称取24.063 g高碘酸钠（NaIO4），用去离子水溶解，转移到250 mL容量瓶中，超声30 min使其完全溶解。称取10 g MCC样品粉末，置于烧杯中并加入所配的0.37 mol/L NaIO4溶液250 mL，用0.1 mol/L的盐酸调节pH值到4左右。用锡纸将烧杯完全包裹以营造黑暗条件，以40℃、600 r/min搅拌180 min，随即加入6 mL乙二醇结束反应，调节pH值到8左右再继续搅拌30 min，静置30 min。将所得到的悬浮液倒入3 500 Da的透析袋中透析48 h，期间每8 h将析出溶液更换为去离子水。经冷冻干燥后得到氧化的MCC，即DAC。
1.3.3 L-Met的功能化接枝
称取10 g上述所得DAC，根据DAC与所用L-Met物质的量比为1∶1称取L-Met，并将二者混合在250 mL去离子水中，在40℃、400 r/min的条件下搅拌混匀5 min后加入5 mL二甲基亚砜，并继续搅拌反应6 h。然后加入5 g硼氢化钠（NaBH4），静置至无气泡产生后，加入6 mL无水乙醇终止反应。使用去离子水洗涤所得产物2～3次后，将所得产物转移至透析袋用去离子水透析48 h，期间每8 h更换去离子水，以除去产物中掺杂的过量离子。最后冷冻干燥得到最终产物M-MCC。
1.3.4 M-MCC表征分析
1.3.4.1微观形貌及结构
采用SEM对改性后的M-MCC表面微观结构进行观察，样品通过喷金提高电导率后进行测试，在不同放大倍数下进行拍照。
1.3.4.2表面官能团和元素分析
通过FTIR对M-MCC进行表征，扫描范围为4 000～400 cm-1，以确定材料的成功合成。通过能量色散X射线谱（energy dispersive spectrometer，EDS）以及X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）测试M-MCC中各元素的分布和存在情况。
1.3.4.3 X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）和热重分析
通过XRD表征了M-MCC的晶体结构，射线为CuKα，加速电压为40 kV，加速电流为15 mA，扫描速率2°/min，扫描范围2θ为5°～90°。
通过热重分析仪（thermogravimetric analysis，TGA）表征M-MCC的热稳定性和受热分解过程。
1.3.5抑菌性能测定
1.3.5.1 M-MCC的体外抗氧化活性测定
将M-MCC加入去离子水中配制成不同质量浓度梯度的悬浮液，质量浓度梯度设置为0.1、0.5、1、5、10、20 mg/mL。
使用7 mmol/L的ABTS阳离子自由基溶液与过硫酸钾溶液在25℃黑暗条件下反应12 h，以生成稳定的氧化ABTS阳离子自由基。用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）稀释ABTS阳离子自由基溶液至用紫外分光光度计检测在734 nm波长处的吸光度为0.65～0.75，保存溶液备用。稀释后的ABTS阳离子自由基溶液取200μL与20μL不同浓度梯度的样品溶液混匀，并在黑暗条件下静置反应10 min后在734 nm波长处测定溶液的吸光度。同时以抗坏血酸作为反应的阳性对照。ABTS阳离子自由基清除率按下式计算：
式中：A0为空白实验组的吸光度（以超纯水代替样品）；A1为样品吸光度；A2为标准组吸光度（以PBS替代稀释后的ABTS阳离子自由基溶液）。
1.3.5.2 M-MCC的MIC和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的确定
MIC是指无法以肉眼观察到细菌生长的抑菌剂最低抑制浓度。MIC和MBC的测定：将得到的M-MCC以1、5、10、15、20 mg/mL的质量浓度梯度溶解于10 mL的无菌液体培养基中。液体培养基为3 g/100 mL的胰蛋白大豆肉汤。向其中加入100μL浓度为106 CFU/mL的菌悬液，置于37℃恒温培养箱中培养24 h。观察菌体生长情况和培养液浑浊情况，24 h后培养液依然澄清的M-MCC最小浓度即为M-MCC的MIC。取100μL培养液均匀涂布在固体培养基表面，置于37℃恒温培养箱培养24 h，观察菌落生长情况。没有菌落生长的最小M-MCC浓度即为M-MCC的MBC。
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