基于革兰氏阳性菌生长曲线等指标评价纤维素基抑菌材料L-Met改性MCC（M-MCC）抑菌效果（三）
1.3.5.3 M-MCC处理下细菌生长曲线测定
分别以1 MIC和2 MIC的M-MCC为处理组，空白组不加入抗菌剂，向其中分别加入200μL浓度为106 CFU/mL的菌悬液，置于恒温培养箱中37℃，每2 h在600 nm波长处用酶标仪测定OD600 nm，并记录数据，绘制细菌生长曲线。
1.3.5.4 M-MCC对细胞膜通透性的影响测定
将培养24 h的L.monocytogenes和S.aureus在8 000 r/min离心15 min，收集细胞沉淀，用无菌生理盐水洗涤两次，重悬至OD600 nm＝0.6～0.8，作为初始菌溶液备用。以2 mL L.monocytogenes菌悬液+2 mL无菌葡萄糖水为空白对照组，以2 mL菌悬液+2 mL无菌葡萄糖水+2 MIC的M-MCC为1 MIC组，以2 mL菌悬液+2 mL无菌葡萄糖水+4 MIC的M-MCC为2 MIC组。于37℃恒温培养6 h。在8 000 r/min将不同培养时间的混合液分别离心15 min，保留上清液，过0.22μm的滤膜，并用电导率仪测定过滤后上清液的电导率。
1.3.5.5 M-MCC对细胞内容物的影响测定
通过测定细菌细胞核酸及蛋白质的泄漏情况确定M-MCC对细菌细胞内容物的影响，其中利用紫外分光光度计在260 nm波长处测定核酸吸收峰，在280 nm波长处测定蛋白质吸收峰。
将培养24 h的L.monocytogenes和S.aureus在8 000 r/min离心15 min，并收集细胞沉淀，用无菌PBS洗涤两次，重悬至OD600 nm＝0.6～0.8，作为初始菌溶液备用。以4 mL菌悬液为空白对照组，以4 mL菌悬液+MIC的M-MCC为1 MIC组，以4 mL菌悬液+2 MIC的M-MCC为2 MIC组。于37℃恒温培养0、30、60、90、120、150、180 min。在8 000 r/min将不同培养时间的混合液分别离心15 min，保留上清液，过0.22μm滤膜，使用紫外分光光度计分别测定260 nm和280 nm波长处的吸光度。
1.3.5.6 M-MCC对细胞DNA含量的影响测定
将培养24 h的L.monocytogenes和S.aureus在8 000 r/min离心15 min，并收集细胞沉淀，用无菌PBS洗涤两次，重悬至OD600 nm＝0.6～0.8，作为初始菌溶液备用。以2 mL菌悬液为空白对照组，以2 mL菌悬液+MIC的M-MCC为1 MIC组，以2 mL菌悬液+2 MIC的M-MCC为2 MIC组。于37℃恒温培养4 h。向各组中加入20μL 1 mg/mL的DAPI，充分混匀并在遮光条件下反应10 min。取20μL溶液滴加至载玻片上，加盖玻片，通过激光共聚焦显微镜（64×）进行观察，激光共聚焦显微镜的激发波长设置为405 nm，发射波长设置为461 nm。
1.4数据处理
实验数据及图由Excel 2021软件和Origin 2021 Pro软件处理。
2结果与分析
2.1表征分析结果
2.1.1微观形貌及结构分析
为了了解L-Met修饰对MCC形貌结构的影响，观察MCC和M-MCC的微观形貌和结构变化，采用SEM对MCC和M-MCC成像，结果如图2所示。与具有多孔结构、呈现短棒状的MCC相比，L-Met修饰的M-MCC表现出更粗糙的表面，呈片状分布，且表面覆盖有颗粒状纤维。这种表面结构改变可能有助于增加M-MCC对细菌的接触面积，进而提高抗菌活性，这有待进一步的确定。
图2 MCC与M-MCC的微观形貌
2.1.2表面官能团及元素分析
使用FTIR对改性前的MCC和改性后的M-MCC表面官能团进行表征，结果如图3所示。在3 337、1 634、1 430、1 320、1 166 cm-1和1 031 cm-1处MCC和M-MCC具有相同的峰，分别对应—OH拉伸振动峰、—OH弯曲振动吸收峰、—H—C—H—面内弯曲振动峰、—O—C—H面内弯曲振动峰、—C—O—C—不对称拉伸振动峰和—C—O—拉伸振动峰，这证明改性后MCC骨架结构不变，说明L-Met的接枝并没有破坏纤维素的基本骨架结构。—C—S—C—的红外吸收峰出现在1 024 cm-1处，1 630～1 680 cm-1碳氧伸缩振动和1 460～1 550 cm-1氮氢弯曲振动证明了酰胺键的存在，间接证明了L-Met成功接枝到MCC表面。
图3 MCC和M-MCC的FTIR
为了进一步了解M-MCC的元素分布情况，采用SEM-EDS和XPS分别对C、O、N、S进行元素分析。M-MCC中的元素分布情况如图4A所示，包含C、O、N、S的EDS总谱图如图4B所示，可以看出，在M-MCC上可以检测到N、S元素，而这两种元素MCC本身不具备，由于L-Met接枝负载在MCC上而出现，这证明L-Met成功接枝到了MCC上。在能谱总谱图中能够观察到N、S的特征峰，也证明了这一结论。
图4 M-MCC的表面官能团分析
如图4C所示，M-MCC由于分子中N、S元素含量较少，全谱分析中并未能直接看到N元素（N1s）和S元素（S2p）的结合峰。M-MCC的C1s结合能为286.11 eV，O1s结合能为532.5 eV。进一步对N1s和S2p的特征谱峰进行精细扫描分析，由峰形可以判断出N、S元素的存在，但其较小的峰面积和峰强度也证实了N、S元素在M-MCC中含量较低。M-MCC的原子百分比如表1所示。由XPS所得到的N、S元素在M-MCC上的原子百分比仅为0.94%和0.55%，而C、O元素原子百分比则高达57.61%和40.91%。
表1 M-MCC的元素分析