牦牛源短小芽孢杆菌生长曲线测定及药敏试验、体外抑菌结果解读（二）
1.4细菌16S rRNA PCR扩增、测序以及同源性和系统进化树分析
将分离纯化后的菌液用16S rRNA引物按照说明书进行PCR扩增，产物在10 g·L-1的琼脂糖凝胶中进行电泳。将含有目的条带的PCR产物原液送至北京擎科生物科技有限公司进行一代测序;将纯化后的菌液送至上海凌恩生物科技有限公司进行基因组DNA提取以及全基因组测序。使用PacBio RS和Illumina测序平台对TS1基因组进行全基因组测序。使用ABySS进行基因组组装，再使用canu来组装PacBio校正后的长读数，最后用GapCloser填补剩余的局部内部空白，并纠正单碱基多态性，得到最终的组装结果。用Circos v0.64绘制完整基因组圈图。将测序得到的一代测序即16S rRNA序列提交到NCBI中进行BLAST比对，将同源性高于99%的菌株以及其他芽胞杆菌属的代表菌株用Mega 5.0软件建立系统进化树;将全基因组测序的47个序列片段提交到BAGEL4(http://bagel.molgenrug.nl/)与数据库进行比对，预测TS1含有的抗菌基因。将预测含有抗菌基因的序列片段用SnapGene 4.3.6软件分析并绘图。
1.5菌株的形态以及生化鉴定试验
将TS1菌株按照革兰氏染色试剂盒的说明书进行染色镜检观察其形态;将纯化的TS1菌液按生化鉴定管说明书接种于不同细菌生化鉴定管中，于37℃恒温培养箱培养24 h，观察结果并参照细菌生化鉴定编码册进行鉴别。
1.6菌株的生长曲线测定及耐酸、耐胆盐试验
将纯化的TS1菌株按10 mL·L-1的接种量接种到新鲜的LB培养基中，取200μL菌液加入96孔板中，设置3个重复，置于37℃的酶标仪中，每隔1 h测量D600值，绘制生长曲线。
取50μL纯化后的TS1菌液分别加入4 950μL pH值为3.02、4.06、5.03、6.04的LB液体培养基中，再取50μL纯化后的菌液加入4 950μL正常LB液体培养基中作为对照，同时放入37℃、160～180 r·min-1恒温振荡培养箱培养16～18 h，用酶标仪分别测量酸性培养液和对照培养液培养的菌液D600值，计算菌株存活率。
另取50μL纯化后的TS1菌液分别加入4 950μL牛胆盐浓度为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%的LB液体培养液中，再取50μL活化后的菌液加入4 950μL LB液体培养基中作为对照，同时放入37℃、160～180 r·min-1恒温振荡培养箱振荡培养16～18 h，用酶标仪分别测量含胆盐的培养液和对照培养液培养的菌液D600值，计算菌株存活率。
1.7不同抗菌药物对TS1菌株的抑菌活性
用无菌生理盐水将TS1纯化菌液稀释至0.5麦氏浓度(约1×108 CFU·mL-1)，将稀释后的TS1菌液均匀铺于LB固体培养基中，选取六大类15种抗菌药物，用K-B药敏纸片法间隔一定距离贴药敏纸片(具体型号见表1)，于37℃恒温培养18 h后测量抑菌圈平均直径(mm)，参照CLSI M100ED30的结果判读标准描述TS1耐药结果。
表1药敏纸片信息
1.8 TS1菌株的体外抑菌试验
以大肠杆菌(ATCC25922)、沙门氏菌(ATCC58785)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、猪链球菌(WH1609)作为指示菌，采用琼脂扩散打孔法测定抑菌圈，每组设置3个重复。将100μL指示菌均匀铺于LB固体培养基中，打孔后在孔中加入50～80μL的纯化TS1菌液，37℃恒温培养24 h，测量抑菌圈直径，以抑菌圈平均直径(mm)描述抑菌效果。
选取革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的代表菌株金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和大肠杆菌(ATCC25922)作为指示菌进行后续试验。将纯化后的菌液放入高速冷冻离心机中5 000 r·min-1离心5 min获得菌体和上清液，用无菌PBS清洗菌体1～2次保证菌体的纯度。然后采用打孔法设置试验分组:阴性对照组、TS1全菌液组、上清液组以及菌体组，37℃培养24 h，进行TS1菌体和上清的抑菌试验，以有无抑菌圈判定其抑菌效果。
2结果与分析
2.1短小芽胞杆菌TS1 16S rRNA PCR扩增与系统进化树分析
从49株益生菌中分离、筛选得到1株各方面性能相对比较好的菌株，将其命名为TS1，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为NO.2022538。TS1 16S rRNA PCR扩增结果(图1-A)显示:在1 000～2 000 bp处出现明显条带，且阴性对照组没有出现条带。系统发育树结果见图1-B，BLAST分析发现与TS1 16S rRNA同源性高于99%的菌株均属于短小芽胞杆菌，且与Bacillus pumilus EE112-P4聚在一支。
图1 TS1 16S rRNA PCR扩增结果与系统进化树分析
2.2 TS1菌株的形态以及生化鉴定结果
TS1革兰氏染色为阳性，细菌形态为单个、短直、杆状(图2-A);TS1在LB培养基上生长状况良好，菌落形态大多为直径2～3 mm中间稍有凹陷的圆形或者椭圆形(图2-B);将TS1分别接种不同的生化反应鉴定管，按说明书进行培养，根据生化鉴定结果(表2)并对照细菌生化鉴定编码册确定该菌株为短小芽胞杆菌。
图2 TS1革兰氏染色结果及菌株形态
表2 TS1的生化鉴定结果
图3 TS1的生长曲线及耐酸、耐胆盐结果
2.3 TS1的生长曲线测定及耐酸耐胆盐试验
用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统每隔2 h测定TS1 48 h的生长曲线(图3-A)，结果显示，TS1在培养约4 h进入对数生长期，繁殖快速，菌体浓度增加，在22 h左右到达平台期且48 h仍然保持稳定，说明稳定期的维持时间长;由图3-B和C可知，TS1在低pH值和高胆盐含量下存活率仍然较高，说明TS1能在畜禽的胃以及肠道中存活。