O 型口蹄疫病毒 3D 突变体重组 FMDV 的鉴定及生长曲线的测定（二）
1.4 重组病毒的拯救
测序正确的全长质粒 rFMDV-M403A 与 rFMDV-WT 各取 2.5 μg 与 5 μL Lip3000 混合后，转染生长至 60％～90％的单层 BHK21 细胞中（步骤见试剂盒说明），同时设置正常细胞作为对照。 转染完成后，置 37 ℃、50 mL/L CO2 恒温培养箱继续培养 48～72 h，每日观察细胞病变（cytopathic effect，CPE）情况，约 80％～90％细胞出现显著 CPE 时收获样品，经－80 ℃冰箱反复冻融 2～3 次后，在 BHK21 细胞上连续传 10 代，置－80 ℃冰箱保存病毒备用。
1.5 重组病毒的鉴定
将出现明显 CPE 的重组病毒上清经反复冻融后，用 Trizol 裂解法提取总 RNA，经反转录酶反转录后，用引物 FMDV-MA-mutant-F：cctgaagctcatggagaagag，FMDV-MA-mutant-R：gcaggtaaagtgatctgtagc 扩增目的片段，回收后送擎科生物科技股份有限公司进行测序，以鉴定重组病毒的正确性。
1.6 重组病毒的生物学特性分析
1.6.1 病毒的传代和突变稳定性检测 鉴定正确的重组病毒按 5％接种量在 BHK21 细胞上连续传至第 10 代，观察记录每代出现 CPE 的时间，将第 8 代和第 10 代病毒用 Trizol 裂解法提取总 RNA，用引物 FMDV-MA-mutant-F/FMDV-MA-mutant-R 进行 RT-PCR 扩增片段基因，检测确保重组病毒在传代过程中氨基酸能稳定突变。
1.6.2 一步生长曲线的绘制
将单层 BHK21 细胞分别接种 0.1 倍体积的第 10 代 rFMDV-M403A 与 rFMDV-WT 病毒液，吸附 1 h 后，弃去病毒液，换成新鲜培养基后，在不同时间点取样，用于测定病毒滴度。 根据测定的病毒滴度结果来绘制病毒一步生长曲线。
1.6.3 乳鼠感染试验
1.6.3.1 乳鼠存活率试验 将在 BHK21 细胞上传代稳定的重组毒用 PBS 缓冲液进行 1 ∶ 1 000 稀释，经颈背部皮下注射 2～4 日龄乳鼠，rFMDV-M403A 与 rFMDV-WT 各注射 10 只，接种量为 50 μL／只，同时设置空白对照组。 连续观察 8 d，记录乳鼠死亡情况，根据致死情况绘制存活率图。
1.6.3.2 病毒在肝中的复制情况 同样使用在 BHK21 细胞上传代稳定的重组病毒经 PBS 缓冲液 1 ∶ 1 000 稀释后，经颈背部皮下注射 2～4 日龄乳鼠，rFMDV-M403A 与 rFMDV-WT 各注射 7 只，接种量为 50 μL/ 只。 连续观察 7 d，中途死亡的乳鼠收集肝。 当到达第 7 天乳鼠状态较好，则全部安乐死并收集肝。 将肝分成 2 份，进行病毒载量和组织病理分析。 1 份研磨后提取组织 RNA，用 RT-qPCR 方法定量肝中的病毒 RNA 量，另 1 份交由武汉赛维尔生物科技有限公司进行组织病理分析。
2 结果
2.1 表达 O 型口蹄疫 3D 蛋白的重组 FMDV 质粒的构建与鉴定
根据相关研究，笔者设计了 FMDV 的 3D 蛋白第 403 位甲硫氨酸突变成丙氨酸的完整 3D 蛋白，并委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。 构建策略见图 1。
图 1 O 型 FMDV 3D 蛋白中 M403 位点突变的全长 cDNA感染性克隆构建策略
2.2 含突变氨基酸全长质粒的构建
合成的质粒使用 BamH Ⅰ和 Not Ⅰ酶切出目的片段（3 172 bp）与载体（2 192 bp）（图 2）。 将目的片段连接到目标载体（pcDNA3.1）上，测序结果显示，已成功构建了包含突变氨基酸的全长质粒。
图 2 FMDV 感染性克隆 pcDNA3.1 的构建
2.3 转染和病毒拯救
单层 BHK21 细胞在 6 孔板中生长至 60％～90％时用于转染，将质粒 pFMDV-3D-M403A-O 和 pFMDV-WT-O 转染至 BHK21 细胞，置 CO2 培养箱中 37 ℃继续培养 48 h 后，细胞出现显著的 CPE，表现为细胞变圆并脱落，成单个或葡萄状分布，但接种 rFMDV-M403A-O 质粒的细胞出现 CPE 时间较晚，而对照细胞形态完好，轮廓清晰。收取病毒，经－80 ℃冰箱反复冻融 3 次，继续在 BHK21 细胞上传代，直至出现 CPE 的时间缩短，病变更加典型（图 3）。
图 3 突变毒株 rFMDV-M403A 和亲本毒株 rFMDV-WT 在 BHK21 细胞上的 CPE 分析
2.4 重组 FMDV 的鉴定
为了鉴定重组病毒的基因组序列正确，收集传至第 8 代和第 12 代的重组病毒 rFMDV-M403A，用 Trizol 法从转染的 BHK21 细胞中提取总 RNA，设计特异性引物，通过 RT-PCR 分别扩增含有第 403 位氨基酸的基因片段。 测序结果（图 4）显示，拯救的重组病毒的 3D 蛋白第 403 位甲硫氨酸成功突变成丙氨酸，且能够稳定遗传。
图 4 rFMDV-M403A 毒株与亲本毒株 rFMDV-WT 的部分鉴定结果
A：第 12 代 rFMDV-M403A 的部分基因序列；B：第 12 代亲本毒株 rFMDV-WT 的部分基因序列。
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