不同乙醇、乙酸、氯化钠、浓度对小米醋发酵过程中醋酸菌生长曲线的影响（三）
2.2生理生化实验结果
将前期分离筛选出的24株菌根据实验方法1.3.3节进行生理生化实验，结果如表1所示。24株菌在接触酶、甘油生酮、乙醇氧化、发酵葡萄糖及产葡萄糖实验中为阳性反应，在氧化酶、产水溶性色素中为阴性反应;在运动性实验中，除菌株SY01、SY02、SY03、SH06、GL14、GL19为阴性反应外，其余菌株均为阳性反应;乳酸氧化实验中，除菌株GL09、GL17、GL18、SZ21、RH22、XM23、XM24菌为阴性反应外，其余菌株为阳性;在乙酸氧化实验中，除菌株RH05、SH06、GL09、GL11、SY15、GL16、SZ21、RH22外，其余菌株呈现阳性反应。
综合以上生理生化实验结果，对照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步确定24株菌为醋酸杆菌属(Acetobacter)。
2.3定性实验结果
将前期分离筛选出的24株菌根据实验方法1.3.4.1节进行产酸定性实验，结果如表2所示，除菌株GL09外，其他菌株均能产生明显的红褐色沉淀，说明菌株GL09不具备产醋酸能力，因此鉴定该菌株不属于醋酸杆菌属。
注:“-”表示无红褐色，“+”表示红褐色不明显，“++”表示红褐色较明显，“+++”表示红褐色明显。
2.4醋酸菌定量实验结果
产酸量是反映醋酸菌的重要指标，筛选产酸能力较强的醋酸菌对提高醋醅酸度，改善传统食醋工艺具有重要作用。
本研究对比24株菌的产酸量，以AS1.41为对照菌。由图2可知，从小米醋发酵过程醋液、醋醅样品中共筛选出24株菌，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL11以及GL19产酸能力强，其产酸量分别为43.05、45.30、43.35、49.50、45.45、49.95 g/L;菌株SY03、RH04、RH05、YH08、GL10、XM12、SY15、GL16、GL17、GL18产酸能力适中，产酸量分别为38.10、38.05、31.80、35.70、38.65、32.25、38.20、38.25、39.15、38.45 g/L;菌株XM13、GL14、SZ21与对照菌株AS1.41(27g/L)相差不大，产酸量分别为27.50、29.85、27.60 g/L;菌株XM20、RH22、XM23、XM24产酸量低于对照菌株AS1.41(27g/L)，产酸量分别为19.2、19.05、18.9、19.5 g/L。谢锦明在陕西民间醋醅中成功筛选出一株热带醋酸菌(Acetobacter tropicalis)，其产酸量高达42g/L。本实验结果共有6菌株产酸达到42g/L以上，与谢锦明研究结果相比，菌株产酸能力较强。
2.5醋酸菌耐受性实验结果
2.5.1耐乙醇能力分析
通过前期产酸定量实验，共筛选出6株优良菌株，分析其乙醇耐受性。结果如图3所示，乙醇从3%增加至11.0%过程中，各菌株生长量呈现下降趋势，而产酸量呈现先增加后降低的趋势。菌株AS1.41、SY01、YH07、GL11在3%乙醇时测得最大产酸量，其中AS1.41产酸为23.9g/L;菌株SY02、SH06、GL19在5%乙醇时生长量及产酸量较好，其中SY02产酸量最高，可达38g/L。当乙醇增至7%时，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL11、GL19及对照菌生长量及产酸量呈下降趋势，此时SY02产酸量最高为18.3g/L，而AS1.41产酸为9.6g/L。当乙醇增至7%~9%时，菌株SY02、SH06、GL19生长量仍分别为0.690、0.485、0.689，而其余4株菌生长量和产酸量均受到明显影响，对照菌AS1.41停止产酸。因为乙醇有抑制细菌生长的作用，所以当初始乙醇添加量达到醋酸菌耐受临界点时，菌种的生长变化慢，导致其产酸下降甚至停止。通过对比可知，菌株SY01、SY02、SH06在高浓度乙醇下生长量及产酸量优于其他4菌株，拥有较好的乙醇耐受性。
2.5.2耐氯化钠能力分析
通过前期产酸定量实验，共筛选出6株优良菌株，分析其氯化钠耐受性。结果如图4所示，氯化钠质量浓度从2g/L增至6g/L时，菌株生长及产酸量基本不受影响;从4g/L增至8g/L时，对照菌生长量及产酸量呈现明显下降趋势;在质量浓度为10g/L时几乎停止产酸;从2g/L增至6g/L时，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL11及GL19生长量及产酸量受到较小影响;从6g/L增至10g/L时，菌株SY02、SH06、GL19生长量仍分别0.571、0.724、0.706，产酸量分别为12.60、13.80、17.84 g/L，而菌株SY01、YH07、GL11生长量和产酸量呈现明显下降趋势，谢锦明等研究发现，醋酸菌在氯化钠浓度较低时仍可以生长，但随着浓度增加生长会受到严重抑制，影响其产酸能力。总的来看，氯化钠对菌株SY01、YH07、GL11生长影响较大，因此在培养时，氯化钠尽量控制在6g/L以内，保证菌株能较好产酸及生长。通过比较可知，在一系列氯化钠浓度下，菌株SY02、SH06、GL19生长量和产酸量能力优于其他菌，拥有较好的氯化钠耐受性。
2.5.3耐乙酸能力分析
通过前期产酸定量实验，共筛选出6株优良菌株，分析其乙酸耐受性。结果如图5所示，随着乙酸浓度不断增加，7株菌产酸量均呈现先上升后下降的趋势。当乙酸为2.0%时，GL11、GL19及对照菌产酸量达到最大，其中GL19及对照菌产酸量分别为42.90、28.95 g/L;当乙酸为3.0%时，菌株SY01、SY02、SH06、YH07产酸量达到最大，其中SY02产酸量最高为40.80g/L，而对照菌产酸量为24.60g/L;当乙酸从2.0%增至3.0%时，所有菌生长量及产酸量受到较小影响，当乙酸为4.0%时，菌株YH07、GL11及对照菌生长量受到明显抑制，而SY01、SY02、SH06、GL19生长量分别为0.531、0.471、0.435、0.450，产酸量仍达到23 g/L以上，当乙酸为5.0%时，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL19产酸量低于13g/L。因为过酸环境会影响醋酸菌生长，而醋酸菌产酸能力也与其机体内的酶有关，过酸和碱性的环境都会导致相关酶活力降低，从而影响醋酸菌产酸能力。通过对比可知，菌种SY01、SY02、SH06、GL19在乙酸存在下生长量及产酸量优于其他菌株，拥有较好的耐乙酸能力。
综合以上耐受性结果发现，菌株SY02、SH06、GL19的耐醇、耐氯化钠、耐酸能力较强，具体表现为:乙醇耐受可达9.0%，氯化钠耐受可达10g/L，乙酸耐受可达4.0%。因此确定菌株SY02、SH06、GL19为目标菌株，用于后续研究。
2.6生长曲线测定结果
实验筛选3株耐受性较强的菌株SY02、SH06和GL19，测定其生物量和生长曲线，结果如图6所示，菌株SY02和SH06的活菌数及OD₆₀₀值最大分别为1.755、0.967，36~48h处于稳定期，48h后活菌数开始呈现下降趋势，逐渐进入衰亡期。菌株GL19的活菌数和OD值均在24~48h生长繁殖速度快，处于对数期，菌体最大浓度分别为6.87 lg CFU/mL，48~60h处于稳定期，60h后活菌数逐渐进入衰亡期。醋酸菌SY02、SH06、GL19都能在较短时间内进入对数期，在这个阶段，菌体以几何级数增长，对外界环境具有强大的抵抗力。
2.7分子生物学鉴定结果
2.7.1核苷酸序列分析
将菌株SY02、SH06及GL19的16S rDNA序列上传到NCBI数据库进行对比，结果见表3，对比发现3株菌株与序列号为NR_178820.1的A.pasteurianus同源性最高，相似度分别为99.50%、99.8%及99.78%。因而可确定筛选出来的3株菌均属于巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)。
3结论
本实验从传统固态小米醋的醋液及醋醅中筛选得到24株菌，经定性实验、耐受性实验等筛选出3株产酸能力达到43g/L以上，能耐受9%乙醇、10g/L氯化钠和4.0%乙酸的优良醋酸菌;经分子生物学鉴定这3株菌均为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurians)。
由于实验采用的是固态发酵过程中的醋醅及醋液，筛选出来的菌种在原醋醅中占比不高，未开展接种强化发酵应用，后期可将筛选出来的优良醋酸菌强化应用到实际生产中，研究醋酸菌在醋酸发酵阶段的微生物群落变化以及对风味形成机制的影响。